如何判断感受态大肠杆菌制备的质量

感受态细胞的制备

感受态大肠杆菌制备方法

四川大学生命科学学院

试剂配制：

A液：1M，MnCl2；mol/L

B液：1M，HEPES，pH=6.2-6.8，用无菌水配，配后不需灭菌；

C液：称取CaCl20.10g，KCl1.18g，全部转入细口试剂瓶，然后加入46ml三蒸水（一级水），轻轻振荡使所有组分充分溶解。将瓶塞盖上并用牛皮纸、棉线包扎，然后放入灭菌锅121℃高压灭菌备用。

TB缓冲液：

方法步骤：

1、溶液配制取1管B液（0.6ml），全部加入C液(46ml)中，混匀后，再用1ml移液器加

入3.3mlA液，混匀冰浴即可使用。

2、划线得到单菌落37℃培养箱培养过夜（约17h），挑取2-4个形态饱满的单菌落接种

于装有100mlSOB培养基的三角瓶,37℃剧烈振荡（300rpms）培养3-4小时,将培养温度调至18℃剧烈振荡（328rpms）培养，

3、其余与普通感受态差不多，每管加入4mlTB缓冲液，轻轻振荡，使菌体重新悬浮，

4、加入280mlDMSO（可用国产分析纯），混匀后分装入1.5mlEP管，冰上静置15分钟。

5、用纱布将所有装有感受态的EP管包好，用棉线系好后放入液氮中速冻，在液氮中静置12

小时以上

6、取出感受态放入-70℃超低温冰箱备用。

效率

感受态制备

A 大肠杆菌感受态的制备（CaCl2法）（《水稻NR和NIR基因启动子的克隆及功能验证》第38页）

1 材料、设备及试剂

1.1 材料

大肠杆菌DH5α、BL21、Rossette、JM109菌株

1.2试剂

LB液体培养基：

蛋白胨 10g/L

酵母提取物 5g/L

NaCl 10g/L

NaOH（1mol/L） 1mL/L

400mL 0.1M/L预冷的 CaCl2溶液（高温高压灭菌）

50%甘油

75%酒精

95%酒精

液氮

1.3 实验设备

接种环、酒精灯，打火机，75%酒精，95%酒精，50mL灭菌三角瓶4个，250mL灭菌的三角瓶4个，移液抢（5mL、200μL，1000μL），灭菌的枪头（5mL、200μL，1000μL），离心管（1.5mL，50mL）恒温摇床,灭菌锅，紫外分光光度计，超净工作台，制冰机，冰盒，高速冷冻离心机。

2 实验步骤

1、从新鲜培养的大肠杆菌DH5α平板上挑取一个单菌落，接种于5mL新鲜LB培液体养基中，于37℃，200rpm振荡培养过夜。

2、培养1

感受态制备

A 大肠杆菌感受态的制备（CaCl2法）（《水稻NR和NIR基因启动子的克隆及功能验证》第38页）

1 材料、设备及试剂

1.1 材料

大肠杆菌DH5α、BL21、Rossette、JM109菌株

1.2试剂

LB液体培养基：

蛋白胨 10g/L

酵母提取物 5g/L

NaCl 10g/L

NaOH（1mol/L） 1mL/L

400mL 0.1M/L预冷的 CaCl2溶液（高温高压灭菌）

50%甘油

75%酒精

95%酒精

液氮

1.3 实验设备

接种环、酒精灯，打火机，75%酒精，95%酒精，50mL灭菌三角瓶4个，250mL灭菌的三角瓶4个，移液抢（5mL、200μL，1000μL），灭菌的枪头（5mL、200μL，1000μL），离心管（1.5mL，50mL）恒温摇床,灭菌锅，紫外分光光度计，超净工作台，制冰机，冰盒，高速冷冻离心机。

2 实验步骤

1、从新鲜培养的大肠杆菌DH5α平板上挑取一个单菌落，接种于5mL新鲜LB培液体养基中，于37℃，200rpm振荡培养过夜。

2、培养1

大肠杆菌的培养

1. LB培养基配制： （液体培养基） ① 取1L的烧杯，加入适量的一蒸水（＜1000ml），称取胰蛋白胨 10g , 酵母提取物 5g , Nacl 10 g 倒入烧杯中

② 加入磁子搅拌，至完全溶解 ③ 用NaoH调PH=7.0，定容至1L ④ 分装后高压蒸汽灭菌 （固体培养基） ① 在液体培养基的基础上加入琼脂糖：1L液体培养基→15g琼脂糖（用水先溶解） ② 在电炉子上边加热边搅拌至煮沸溶解 ③ 分装后高压灭菌

抗生素的加入温度要求：高压灭菌后，将融化的LB固体培养基置与55℃的水浴中，待培养基温度降到55℃时（手可触摸）加入抗生素，以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。 注意事项：

① 电炉子温度不要太高，烧杯直接加热时电炉子上要加石棉网 高压灭菌时，瓶盖上要插上针头，防止灭菌时瓶盖喷出 2. 倒平板：

培养皿要提前进行灭菌、烘干，在超净工作台里，打开酒精灯，在酒精灯的火焰旁进行操作，倒完后做好标记

3. 接种（平板划线分离法）：

接种环挑取大肠杆菌进行接种：图式：

注意：每次划线前接种环都要灼烧灭菌，再冷却。 4. 37°恒温培养箱培养：

接种好的培养皿正置15分钟，然后倒置放入培养箱过夜培养

倒置培养原因：恒温

3.大肠杆菌电转化及电转感受态细胞的制备

电转化法是利用瞬间高压在细胞上打孔，同时，DNA在电场力的作用下进入细胞，随后

细胞复苏和弥合，从而实现质粒DNA的物理转移。为避免电击时出现“击穿”，即产生电

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流，细胞悬浮液中应含有尽量少的导电离子。转化效率为10～10转化子/μg DNA。

3.1．感受态细胞的制备

（1）感受态细胞及材料准备同钙转化感受态细胞的制备相同。

（2）选合适的大肠杆菌在4℃，3000 rpm下离心10min，弃上清液（如需要，沉淀可在

4℃的10%甘油中保存1～2天）。

（3）弃上清，离心管中加入少量ddH2O，轻柔的悬浮沉淀后，再将水注满离心杯，4℃，3000

rpm离心10min。

（4）重复步骤（3）1次。

（5）小心弃上清（沉淀可能会很松散），再往离心管中加入少量10%甘油（灭菌，预冷），重悬菌体，再加满10%甘油，4℃，4000 rpm离心10min。

（6）用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2～3ml，将细胞按200μl等份装入微量离心管，放置于－80℃下保存。

（7）按照钙转化感受态细胞方法进行转化效率和抗性检测。

3.2．电转化

为了降低离子浓度，待转化的质粒

农杆菌感受态制备

1、划平板，单克隆培养

2、挑单克隆于5ML LB培养基中，摇到饱和（1-2day） 3、50m离心管中4500rpm，15min

4、50ml菌体用1ml氯化钙（预冷）悬浮，冰上操作 5、每100ul分装于冷冻管中，液氮速冻后，-70℃保存

农杆菌转化

1．50ul感受态+5ul质粒，放入液氮速冻2min 2．37℃ 热激5min

3. 加1mlLB，28℃培养3-4h

3. 8000rpm/min去上清，200ulLB悬浮，涂板吹干 农杆菌抗性：利福平+庆大霉素+载体抗性。（GV3101） 庆大霉素 40mg/ml （0.4g/10ml）；利福平 50mg/ml DMSO溶解 200ml LB + 200ul母液

农杆菌转植物

1. 植物去顶三天后转化，转前一天交足水

2. 摇菌OD600=1.2~1.6 （先小摇后，取200ul大摇200ml）

3. 室温5000rpm，15min，弃上清，悬浮于等体积渗透培养基中 （200ml/转化） 每1000ml渗透培养基：1/2 MS 2.42g；蔗糖50g；MES 0.5g；用1M KOH调PH到5.8/5.7，定容到1000ml，加10ul 1mg/ml6-BA，加200

一、电转化感受态细胞的制备

1.用枪头挑取单克隆菌落，投入盛有10ml LB液体培养基的50ml离心管中。（同时做培养基和枪头的空白对照）

2.37℃，220rpm，培养14-16个小时。

3.第二天，以1：100的比例将这10ml菌液倒入1000ml LB液体培养基中，37度，220rpm，振摇2-3小时，每半小时测一次OD，当OD值达到0.3-0.4时，停止培养。 4.将菌液在冰上预冷30分钟，随后将菌液分装到500ml 预冷的离心杯中，4℃，2500rpm离心10分钟。

5.弃上清，离心杯中加入少量ddH2O，使沉淀悬浮后，再将水注满离心杯，4℃，4000rpm离心10分钟。

6.弃上清，加少量灭菌水，重悬菌体，再将水注满离心杯，4000rpm，4℃，离心10min。 7.弃上清，往离心杯中加入少量10%甘油(灭菌，预冷)，重悬菌体，再加满10%甘油, 4℃, 4000rpm, 离心10min。

8.弃上清，每个离心杯中加入5ml10%的甘油，使沉淀悬浮后，将菌液以300ul/管分装于1.5ml的离心管中，-80 ℃冰箱中保存。同时取100 μl感受态加0.01ng puc18直接电穿孔转化，检测转化效率。

9. 次日观察转化子生长情况

感受态细胞的制备

一、 实验原理

受体细胞通过一些特殊方法（如电击法，CaCl2，MnCl2，MgCl2等化学试剂法)的处理后，使细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的状态，成为感受态细胞。

本方案介绍的方法为TSS法和KCM转化法。

二、 材料及准备工作 一）材料准备 试剂、耗材名称 蛋白胨 酵母提取物 氯化钠 琼脂粉 聚乙二醇（PEG8000） DMSO MgCl2 KCl CaCl2 氨苄青霉素 摇菌管 平皿（10cm） 品牌 货号 500ml锥形烧瓶 枪头（1ml，0.2ml） 0.22μm过滤器 50ml注射器 二)试剂配制

1、液体LB培养基（200ml，高压灭菌，4℃保存备用）

蛋白胨 酵母提取物 氯化钠（NaCl）

2、固体LB培养基（2×100ml，高压灭菌）

蛋白胨 酵母提取物 氯化钠（NaCl） 琼脂粉

2×1.0g 2×0.5g 2×1.0g 2×1.5g 2.0g 1.0g 2.0g

温度降低到45℃后（不烫手），取其中一瓶加入氨苄至终浓度100μg/ml（100mlLB加100μl 100mg/ml的氨苄）后铺平皿，另一瓶

感受态细胞的制备方法

1、感受态定义、作用、常用制备方法及原理 2、感受态细胞不好用的原因 3、影响转化效率的原因 4、为何要低温环境制备

1.感受态

定义：细胞能够从周围环境中摄取DNA分子，并且不易被细胞内的限制性核酸内切酶分解时所处的一种特殊生理状态称感受态（competence）。 作用：如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外源DNA。感受态的目的是增加细胞的通透性，以便外源基因进入宿主细胞，实现转化的目的。 优点是细胞膜通透性增大，方便大分子的进入。意义是实验转移外源DNA分子进入受体细胞，完成实验。

常用制备方法：细菌感受态少量制备法（CaCl2法）、细菌感受态大量制备法、细菌电转化法等详见《基因工程实验指导》p153-157.

2.感受态细胞做得不好的原因 一．菌液OD值偏大或偏小 二．原始菌株不好 三．试剂超纯程度不够 四．操作时对菌体伤害过大

3. 影响转化效率的原因

1．细菌的生长状态：实验中应密切注视细菌的生长状态和密度,尽量使用对数生长期的细胞（一般通过检测OD600来控制.DH5α菌株 OD600为 0.5 时细胞密度是 5 × 107/ml ）； 2．所有操作均应在无菌条件和

感受态细胞的制备：

1.以1:100的比例吸取过夜菌液（250ul）加入25ml LB液体培养基中，37℃，200r/min振荡培养2-3h至OD600达到0.5左右（OD600范围0.4-0.6）。 2.将25ml菌液移至预冷的50ml聚丙烯离心管中，在冰上放置30min，使培养物冷却到0℃。 3.于4℃，以4000rpm离心10min，回收细胞。

4.倒出培养液，将管倒置1min（于滤纸/吸水纸上），使最后残留的痕量培养液流尽。

5.每50ml菌液用10ml预冷的0.1mol/L的CaCl2，重悬每份沉淀，放置于冰浴上30min。 6.于4℃，以4000rpm 离心10min，回收细胞。

7.倒出培养液，将管倒置1min（于滤纸/吸水纸上），使最后残留的痕量培养液流尽。

8.每50ml初始培养物用2ml 用冰预冷的0.1mol/L的CaCl2（含15%甘油）重悬每份细胞沉淀。

9.在冰上将细胞分装成小份，100ul/份，防御-70℃冻存。

10.如果当天要用，最好将制好的感受态细胞在4℃放置4h后再用，效果较好。制备好的感受态细胞在4℃放置24-48h内使用，不影响效果。

感受态细胞制备流程图：

过夜菌 250ul加入 25ml