硝酸还原酶的测定方法

一、实验目的和要求

掌握体内法测定植物组织中的硝酸还原酶原理和方法，明确诱导酶含义。 二、实验内容和原理

硝酸还原酶（NR）是植物氮素同化的关键酶，与作物吸收和利用氮肥有关。它催化植物体内的硝酸盐

还原为亚硝酸盐：

--

产生的NO2可以从组织内渗透到外界溶液中，并积累在溶液中，测定NO2含量的增加，即表示该酶活性的大小。

装 NO2含量的测定用磺胺比色法。在酸性溶液中产生的亚硝酸盐与对–氨基苯磺酸（或对–氨基苯磺酰

-

订线

胺）反应产生重氮，再与α–萘胺（或萘基乙烯二胺）偶联形成紫红色的偶氮化合物。生成的红色偶氮化合物在540nm波长下有最大吸收峰，可用分光光度法测定，利用标准曲线确定溶液中NO2-含量。 三、主要仪器设备

1、实验仪器 分光光度计，真空泵，温箱，天平，2个烧杯，移液管若干，试管3支，剪刀。 2、实验试剂 0.1mol/L pH7.5的磷酸缓冲液，对-氨基苯磺酸溶液，α-萘胺溶液，亚硝酸钠标准液

3、实验材料 在15-25℃ 蒸馏水培养一周的大麦苗两组，一组加KNO3，一组加NH4Cl，在白天置光照下处理。

四、操作方法和实验步骤

1、剪取新鲜的叶片两组，一组是处理苗0.

HMG-CoA还原酶抑制剂的合成(上)

维普资讯 http://www.77cn.com.cn

中国医药工业杂志 C iee o ra o h r c uias 0 4 3 1 hn s un l f ama et l 2 0,5(0 J P c ,,,,,,,,,,,,,j J f

综述与专论；‘‘‘‘‘‘‘‘‘‘‘‘‘ -

H—o MG C A还原酶抑制剂的合成 ( 上)蔡正艳，宁奇，周伟澄∞(上海医药工业研究院，上海 2 0 3 ) 0 4 7

摘要：本文综述了近年来上市的全合成 H MG— A还原酶抑制剂药物的合成方法，主要叙述了含醛基、炔基、磺酰基、 Co 膦酸酯基或氨基官能团的侧链的制备以及这些侧链通过Wii— o r O l— oink O e nu n tgH moS ui K cesi lf a o等反应与芳杂环的缩合。 t￣ Y a i 关键词：HMG— A还原酶抑制剂：合成：综述 Co

中图分类号：R 7 . 92 6

文献标识码：A

文章编号：10—2 5 2 0 ) 00 2—6 0 18 5 (0 4 1—6 10

随着首个 HMG. o C A还原酶抑制剂洛伐他汀 ( v sa n ) 1 att,1的上市，他汀类降血脂药

一、脲酶测定(比色法)

1、试剂配制：

（1） pH6.7柠檬酸盐溶液：取368g柠檬酸溶于600mL蒸馏水中，另取295g氢氧化

钾溶于水，再将两种溶液合并，用1N氢氧化钠将pH调至6.7，并用水稀释至2L。

（2） 苯酚钠溶液：称取62.5g苯酚溶于少量乙醇中，加2mL甲醇和18.5mL丙酮，后

用乙醇稀释至100mL（A液），保存再冰箱中。称取27g氢氧化钠溶于100mL水中（B液），保存于冰箱中。使用前，取A、B两液各20mL混和，并用蒸馏水稀释至100mL备用。

（3） 次氯酸钠溶液：用水稀释制剂至活性氯的浓度为0.9％，溶液稳定。 （4） 10％尿素溶液：10g尿素溶于100mL水中。

（5） N的标准溶液：精确称取0.4717g硫酸铵溶于水稀释至1L，则得1mL含0.1mgN

的标液，再将此液稀释10倍制成氮工作液（0.01mg/mL）。

2、操作步骤

称取5ｇ土置于50mL容量瓶中,加1mL甲苯处理,加塞塞紧轻摇15ｍｉｎ;往瓶中加入5mL10%尿素液和10mL的柠檬酸盐缓冲液(ｐＨ6.7),仔细混匀。在37℃恒温箱中培养24ｈ。然后用热至38℃的蒸馏水稀释至刻度(甲苯应浮在刻度以上),摇荡,将悬液过滤。取滤液1mL置于50mL容量

一、过氧化物酶（POD）活性的测定

POD测定参照李合生等（2003）的愈创木酚法方法进行测定，略加改动。 测定：称取样品0.5g，加入5mL 1／15mol／L PH=7.0的磷酸缓冲溶液，冰浴研磨成匀浆，4℃条件下12000r/min离心15min，上清液为粗酶液。然后在试管中加pH 7.0的磷酸缓冲液2 ml，愈创木酚（0.2%）0.5ml，浓度为0.15%的H2O2 0.5ml，取0.3ml的酶提取液加入到试管中，空白以缓冲液代替。在470nm下测定其吸光度，加入酶液时开始计时，每隔30s读数一次，连续记录5分钟。以每分钟每克鲜重增加0.1的酶量作为一个酶活性单位。

△470 ×VT

POD活性=

0.01×t×Vs×W

式中：△470----反应时间内吸光度值的变化；

VT ----提取酶液的总体积（ml） t----反应的时间（min）

Vs ----测定时取用酶液体积（ml） W----样品鲜重（g）

二、多酚氧化酶（PPO）活性的测定

多酚氧化酶活性测定参照朱广廉等(1990)的方法，略加改动。

酶液制备：称取样品0.5g，加入5mL 0.1mol／L PH=6.0的磷酸缓冲溶液

一、过氧化物酶（POD）活性的测定

POD测定参照李合生等（2003）的愈创木酚法方法进行测定，略加改动。 测定：称取样品0.5g，加入5mL 1／15mol／L PH=7.0的磷酸缓冲溶液，冰浴研磨成匀浆，4℃条件下12000r/min离心15min，上清液为粗酶液。然后在试管中加pH 7.0的磷酸缓冲液2 ml，愈创木酚（0.2%）0.5ml，浓度为0.15%的H2O2 0.5ml，取0.3ml的酶提取液加入到试管中，空白以缓冲液代替。在470nm下测定其吸光度，加入酶液时开始计时，每隔30s读数一次，连续记录5分钟。以每分钟每克鲜重增加0.1的酶量作为一个酶活性单位。

△470 ×VT

POD活性=

0.01×t×Vs×W

式中：△470----反应时间内吸光度值的变化；

VT ----提取酶液的总体积（ml） t----反应的时间（min）

Vs ----测定时取用酶液体积（ml） W----样品鲜重（g）

二、多酚氧化酶（PPO）活性的测定

多酚氧化酶活性测定参照朱广廉等(1990)的方法，略加改动。

酶液制备：称取样品0.5g，加入5mL 0.1mol／L PH=6.0的磷酸缓冲溶液

土壤酶测定方法

芳基酰胺酶 Arylamidase （EC 3.4.11.2）

试剂：

1、THAM缓冲液（0.1 M，pH 8.0）：2.44 g 三羟甲基氨基甲烷溶于50 mL水中，用0.05 M H2SO4滴定调节pH，加水稀释溶液至200 mL。

2、L-leucine β-naphthylamide solution L-亮氨酸β-萘胺（8.0 mM）(2 mM)：称取0.2342 g L-亮氨酸β-萘胺盐酸盐溶于水，定容至100 mL。 3、Ethanol 乙醇：（95%）

4、Acidified ethanol 酸化乙醇（0.26 M HCl）：4.32 mL浓HCl加入乙醇中，用乙醇定容至200 mL。

5、p-Dimethylaminocinnamaldehyde solution 对二甲氨基肉桂醛溶液 (0.6 mg/mL)：0.12 g 对二甲氨基肉桂醛溶于乙醇，用乙醇定容至200 mL。 6、标准液β-萘胺溶液（β-naphthylamine）（125 ug/mL）：称取12.5 mg β-萘胺，75 mL蒸馏水，5 mL乙醇，用蒸馏水定容至100 mL。

7、β-萘胺标准曲线：分别吸取1，2，3，4，5，6 mL标

酶活测定方法

还原法

酶与底物在特定的条件下反应,酶可以促使底物释放出还原性的基团。在此反应体系中添加化学试剂 ,酶促反应的产物可与该化学试剂发生反应,生成有色物质。通过在特定的波长下 比色 ,即可求 出还原产物的含量 ,从而计算出酶活力的大小 。 色原底物法

通过底物与特定的可溶性生色基团物质结合,合成人工底物。该底物与酶发生反应后 ,生色基团可被释放出来 ,用分光光度法即可测定颜色的深浅,在与已知标准酶所做的曲线比较后 ,即可求出待测酶的活力。 粘度法

该法常用于测定纤维素酶、木聚糖酶和β-葡聚糖酶 的活力。木聚糖和β-葡聚糖溶液通常情况下可形成极高的粘度,当酶作用于粘性底物时木聚糖和β-葡聚糖会被切割成较小的分子使其粘度大 为降低。基 于Poiseuille定律我们知道 ,只要测定一定条件下溶剂和样品溶液的运动粘度,便可计算特性粘数,并以此来判断酶的活力。 高压液相色谱法

酶与其底物在特定的条件下充分反应后 ,在一定的色谱条件下从反应体系中提取溶液进行色谱分析,认真记录保留时间和色谱图,测量各个样的峰高和半峰高,计算出酶促反应生成物的含量 ,从而换算出酶活力的数值。 免疫学方法

常用 于酶活性分析的免疫学方法包括:免疫电泳法 、

2008中国药学会学术年会暨第八届中国药师周论文集(WORD文档)

萘啶衍生物的合成及其醛糖还原酶抑制活性研究

杜蕊，朱长进

（北京理工大学化工与环境学院，北京，100081）

摘 要：目的 开发一系列带有新型结构的醛糖还原酶抑制剂。方法 基于几种已存在的醛糖还原酶抑制剂的结构，经过4步反应，合成了三种萘啶衍生物，并对其进行体外ALR2活性测试。结果 三种化合物表现出了一定的酶抑制活性，并且三者活性值相近。结论 萘啶化合物的结构骨架合理，经过改进或修饰可能会提高活性。

关键词：醛糖还原酶抑制剂；萘啶；抑制活性

Synthesis of Naphthyridine Derivatives and Research of their Aldose

Reductase Inhibitory Activity

DU Rui, ZHU Chang-jin

(School of Chemical Engineering and Environment , Beijing Institute of Technology , Beijing

100081 , China)

Abstract: Objective A series of aldose reductas

还原糖含量测定方法的研究

含有游离醛基或酮基的糖称为还原糖。所有的单糖（除二羟丙酮），不论醛糖、酮糖都是还原糖。大部分双糖也是还原糖，蔗糖例外。可根据游离醛基或酮基的还原性来测定其含量。 1 测定方法 1.1 高锰酸钾法 1.1.1 原理

还原糖在碱性环境下将铜盐还原为氧化亚铜，在酸性条件下，硫酸铁将氧化亚铜氧化为铜盐，并使硫酸铁还原为硫酸亚铁，最后用高锰酸钾标准溶液滴定硫酸亚铁，根据高锰酸钾的消耗量计算氧化亚铜的含量，再查表得还原糖含量〔1〕。 1.1.2方法

吸取50ml处理后的样品溶液，于400ml烧杯中，加入25ml碱性酒石酸铜甲液及25ml乙液，于烧杯上盖一表面皿，加热，控制在4min内沸腾，再准确煮沸2min，乘热用铺好石棉的古式坩埚或G4垂融坩埚抽虑，并用60℃热水洗涤烧杯及沉淀，至洗液不成碱性为止。（注：还原糖与碱性酒石酸铜试剂的反应一定要在沸腾状态下进行，沸腾时间需严格控制。煮沸的溶液应保持蓝色，如蓝色消失，说明还原糖含量过高，应将样品溶液稀释后重做。）将古式坩埚或垂融坩埚放回原400ml烧杯中，加25ml硫酸铁溶液及25ml水，用玻棒搅拌使氧化亚铜完全溶解，以0.1mol/L高锰酸钾标准液滴定至微红色为终点。同时吸取50m

土壤酶活性测定方法

土壤脲酶的测定方法（苯酚钠—次氯酸钠比色法）

一、原理

脲酶存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。它是一种酰胺酶作用是极为专

性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和二氧化碳、水。土壤脲酶活性与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。

土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。本方法以尿素为基质，根据酶促产物氨与苯酚-次氯酸钠作用生成蓝色的靛酚，来分析脲酶活性。 二、试剂 1）甲苯

2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100ml。

3）PH6.7柠檬酸盐缓冲液：184g柠檬酸和147.5g氢氧化钾（KOH）溶于蒸馏水。将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释定容至1000ml。 4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5g苯酚溶于少量乙醇，加2ml甲醇和18.5ml丙酮，用乙醇稀释至100ml（A液），存于冰箱中；27gNaOH溶于100ml水（B液）。将A、B溶液保存在冰箱中。使用前将A液、B液各20ml混合，用蒸馏水稀释至