对蛋白质准确定量的方法

蛋白质定量的五种方法

方法一 双缩脲法测定蛋白质浓度

[目的]掌握双缩脲法测定蛋白质浓度的原理和标准曲线的绘制。 [原理]

双缩脲(NH2CONHCONH2)在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色化合物，称为双缩脲反应，蛋白质分子中含有许多肽键(-CONH-)在碱性溶液中也能与Cu2+反应产生紫红色化合物。在一定范围内，其颜色的深浅与蛋白质浓度成正比。因此，可以利用比色法测定蛋白质浓度。

双缩脲法是测定蛋白质浓度的常用方法之一。操作简便、迅速、受蛋白质种类性质的影响较小，但灵敏度较差，而且特异性不高。除-CONH-有此反应外，-CONH2、-CH2NH2、-CS-NH2等基团也有此反应。 [操作]

取中试管7支，按下表操作。

各管混匀、放置37℃水浴中保温20分钟。用540nm比色，以空白管调零点，读取各管光密度值。 [计算]

(一)在座标纸上以光密度为纵座标，以蛋白质浓度为横座标绘制标准曲线。 (二)从标准曲线中查出待测血清样本的蛋白质浓度(g／L)，并求出人血清样本的蛋白质 浓度。

(三)再从标准管中选择一管与测定管光密度相接近者，求出人血清样本的蛋白

蛋白质定量的五种方法

方法一 双缩脲法测定蛋白质浓度

[目的]掌握双缩脲法测定蛋白质浓度的原理和标准曲线的绘制。 [原理]

双缩脲(NH2CONHCONH2)在碱性溶液中与硫酸铜反应生成紫红色化合物，称为双缩脲反应，蛋白质分子中含有许多肽键(-CONH-)在碱性溶液中也能与Cu2+反应产生紫红色化合物。在一定范围内，其颜色的深浅与蛋白质浓度成正比。因此，可以利用比色法测定蛋白质浓度。

双缩脲法是测定蛋白质浓度的常用方法之一。操作简便、迅速、受蛋白质种类性质的影响较小，但灵敏度较差，而且特异性不高。除-CONH-有此反应外，-CONH2、-CH2NH2、-CS-NH2等基团也有此反应。 [操作]

取中试管7支，按下表操作。

各管混匀、放置37℃水浴中保温20分钟。用540nm比色，以空白管调零点，读取各管光密度值。 [计算]

(一)在座标纸上以光密度为纵座标，以蛋白质浓度为横座标绘制标准曲线。 (二)从标准曲线中查出待测血清样本的蛋白质浓度(g／L)，并求出人血清样本的蛋白质 浓度。

(三)再从标准管中选择一管与测定管光密度相接近者，求出人血清样本的蛋白

蛋白质各种定量方法的优缺点的比较

1．蛋白质的常规检测方法

1.1 凯氏（Kjeldahl）定氮法

一种最经典的蛋白质检测方法。

原理：样品中含氮有机化合物与浓硫酸在催化剂作用下共热消化,含氮有机物分解产生氨,氨

又与硫酸作用变成硫酸铵。然后加碱蒸馏放出氨,氨用过量的硼酸溶液吸收,再用盐酸标准溶液滴定求出总氮量换算为蛋白质含量。 优点：范围广泛、测定结果准确、重现性好 缺点：操作复杂费时、试剂消耗量大

1.2 双缩脲法

常用于需要快速但并不需要十分精确的蛋白质检测。

原理：双缩脲（NH3CONHCONH3）是 3 分子的脲经180℃左右加热，放出1分子氨后得到

的产物。 在强碱性溶液中，双缩脲与硫酸铜形成紫色络合物（肽键中的氮原子和铜离子配价结合），称为双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，因此可用来测定蛋白质含量。

测定范围：1~10mg（有的文献记载为1~20mg）

优点：较快速，干扰物质少，不同蛋白质产生的颜色深浅相近 缺点：①灵敏度差；

② 三羟甲基氨基甲烷、一些氨基酸和EDTA等会干扰该反应。

1.3 Folin-酚试剂法

原理：Folin-酚法的原理与双缩脲法大体相同，利用蛋白质中的肽键与铜结合产生双缩脲反应。同时也由于

蛋白质的定量测定——微量凯氏定氮法(micro Kjeldahl method)

生物材料的含氮量测定在生物化学研究中具有一定的意义，如蛋白质的含氮量约为16％，测出含氮量则可推知蛋白含量。生物材料总氮量的测定，通常采用微量凯氏定氮法。凯氏定氮法由于具有测定准确度高，可测定各种不同形态样品等两大优点，因而被公认为是测定食品、饲料、种子、生物制品、药品中蛋白质含量的标准分析方法.

实验原理

生物材料的含氮量测定在生物化学研究中具有一定的意义，如蛋白质的含氮量约为16％，测出含氮量则可推知蛋白含量。生物材料总氮量的测定，通常采用微量凯氏定氮法。凯氏定氮法由于具有测定准确度高，可测定各种不同形态样品等两大优点，因而被公认为是测定食品、饲料、种子、生物制品、药品中蛋白质含量的标准分析方法。其原理如下： 1. 消化：有机物与浓硫酸供热，使有机氮全部转化为无机氮——硫酸铵。为加快反应，添加硫酸铜和硫酸钾的混合物；前者为催化剂，后者可提高硫酸沸点。这一步约需30min至1h，视样品的性质而定。

2. 加碱蒸馏：硫酸铵与NaOH(浓)作用生成(NH4)OH, 加热后生成NH3, 通过蒸馏导入过量酸中和生成NH4Cl而被吸收。

3. 滴定：用过量标准HCl吸收

蛋白质的定量测定——微量凯氏定氮法(micro Kjeldahl method)

生物材料的含氮量测定在生物化学研究中具有一定的意义，如蛋白质的含氮量约为16％，测出含氮量则可推知蛋白含量。生物材料总氮量的测定，通常采用微量凯氏定氮法。凯氏定氮法由于具有测定准确度高，可测定各种不同形态样品等两大优点，因而被公认为是测定食品、饲料、种子、生物制品、药品中蛋白质含量的标准分析方法.

实验原理

生物材料的含氮量测定在生物化学研究中具有一定的意义，如蛋白质的含氮量约为16％，测出含氮量则可推知蛋白含量。生物材料总氮量的测定，通常采用微量凯氏定氮法。凯氏定氮法由于具有测定准确度高，可测定各种不同形态样品等两大优点，因而被公认为是测定食品、饲料、种子、生物制品、药品中蛋白质含量的标准分析方法。其原理如下： 1. 消化：有机物与浓硫酸供热，使有机氮全部转化为无机氮——硫酸铵。为加快反应，添加硫酸铜和硫酸钾的混合物；前者为催化剂，后者可提高硫酸沸点。这一步约需30min至1h，视样品的性质而定。

2. 加碱蒸馏：硫酸铵与NaOH(浓)作用生成(NH4)OH, 加热后生成NH3, 通过蒸馏导入过量酸中和生成NH4Cl而被吸收。

3. 滴定：用过量标准HCl吸收

实验报告

学院：第二临床医学院 专业：临床医学 年级：2013级 班级：1班 姓名： 学号： 日期：2014,3,8 得分： 实验课程：生物化学实验

实验名称：蛋白质的定量测定（一）——紫外吸收测定

【实验目的】

了解紫外线吸收法测定蛋白质含量的原理。 掌握紫外分光光度计的使用方法。 【实验原理】

由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值（A280）与其含量呈正比关系，可用作定量测定。

利用紫外线吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因此，在蛋白质和酶的生化制备中（特别是在柱层析分离中）广泛应用。此法的缺点是：

（1）对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差；

（2）若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外线的物质，会出现较大的干扰。不同的蛋白质和核酸的紫外线吸收是不相同的，即使经过校正，测定结果也还存在一定的误差。但可作为初步定量的依据。

【实验器材与材料】

（一）试剂

1、标准蛋白溶液

牛血清蛋白预先经凯式定氮法测定蛋白氮

实验报告

学院：第二临床医学院 专业：临床医学 年级：2013级 班级：1班 姓名： 学号： 日期：2014,3,8 得分： 实验课程：生物化学实验

实验名称：蛋白质的定量测定（一）——紫外吸收测定

【实验目的】

了解紫外线吸收法测定蛋白质含量的原理。 掌握紫外分光光度计的使用方法。 【实验原理】

由于蛋白质分子中酪氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，因此蛋白质具有吸收紫外线的性质，吸收高峰在280nm波长处。在此波长范围内，蛋白质溶液的光吸收值（A280）与其含量呈正比关系，可用作定量测定。

利用紫外线吸收法测定蛋白质含量的优点是迅速、简便、不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定。因此，在蛋白质和酶的生化制备中（特别是在柱层析分离中）广泛应用。此法的缺点是：

（1）对于测定那些与标准蛋白质中酪氨酸和色氨酸含量差异较大的蛋白质，有一定的误差；

（2）若样品中含有嘌呤、嘧啶等吸收紫外线的物质，会出现较大的干扰。不同的蛋白质和核酸的紫外线吸收是不相同的，即使经过校正，测定结果也还存在一定的误差。但可作为初步定量的依据。

【实验器材与材料】

（一）试剂

1、标准蛋白溶液

牛血清蛋白预先经凯式定氮法测定蛋白氮

班级：________________ 姓名：________________ 学号：________________ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _装_ _ _ _ _订_ _ _ _ _线_ _ _（装订线内禁止填写答案）_ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____

一、单项选择题,（在备选答案中只有一个是正确的）(本大题共100小题,100分)

1. 维系蛋白质α-螺旋和β-折叠结构稳定的化学键是

A.氢键 B.离子键 C.二硫键 D.疏水作用 E.肽键

(4)氨基酸的疏水侧链很少埋在蛋白质分子的内部 A.1,2,3 B.1,3 C.2,4 D.4 E.1,2,3,4

11. 在电场中，蛋白质泳动速度取决于

A.蛋白质颗粒的大小 B.蛋白质颗粒的形状 C.带净电荷的多少

D.A+C

E.蛋白质所带电荷的多少，分子量的大小

第五章 蛋白质（Protein) 本章主要内容（Content）

蛋白质的一般性质（General aspects)

■ 结构 ■ 蛋白质-水相互作用，影响蛋白质水溶性的因素 ■ 蛋白质-脂的相互作用 蛋白质的变性（Denaturation）

■ 蛋白质变性产生的效应 ■ 导致蛋白质变性的物理因素 ■ 导致蛋白质变性的化学因素

蛋白质的功能性质（Functional Properties） 定义与分类

水化性质 溶解度与粘度、凝胶作用

组织化 热凝结和形成、纤维的形成热塑挤压、面团 乳化性质 乳化能力与乳化稳定性 起泡作用 起泡性与泡沫稳定性 ?蛋白质的营养特性（Nutritional properties） ?蛋白质的开发利用（Utilization）

植物蛋白质和动物蛋白质：浓缩蛋白质与分离蛋白质利用微生物生产蛋白质——单细胞蛋白 第一节 引言（Introducti

■ 蛋白质是构成生物体的基本物质。

病毒，细菌，激素，植物和动物细胞原生 质都是以蛋白质为基

1

础的。

■ 酶是蛋白质 已经发现数以千计的酶。 ■ 蛋白质是由20种氨基酸构成的聚合物 一、蛋白质的分类： （一）根据组成分类

? 简单蛋白质（

蛋白质 (Protein)

组成（Composition）

?生物大分子（Macromolecule） ?构件分子—氨基酸 (Amino acid)

氨基酸 (Amino acids) R—基团

对氨基酸性质影响强烈

?非极性、疏水性。 ?极性、电中性。

?极性、负电荷、碱性。 ?极性、正电荷、酸性。

水溶液中的氨基酸 两性电解质

水溶液中的氨基酸 酸性氨基酸

水溶液中的氨基酸 碱性氨基酸

分类（Classification）

?非极性、疏水性的 ?极性、电中性的

?极性、带负电荷、碱性的 ?极性、带正电荷、酸性的

?植物蛋白与动物蛋白在氨基酸组成上

的差异——

?人体必须氨基酸——

8种氨基酸

?蛋白质的生物学效价（PER） ?转基因植物蛋白

?各种氨基酸配比的蛋白食品

一级结构（Primary structure）

?氨基酸——氨基+羧酸基 ?肽键(Peptide bond)

一级结构（Primary structure）

?线性结构(Linear polymer of amino

acids) ?氨基酸序列（Sequence）——蛋白质分子

?氨基末端（N-terminal） ?羧酸基末端（C-terminal）

?氨基酸残基(Amin