酵母菌蛋白质含量

《生命科学文献与论文写作》课程论文

利用酵母菌生产蛋白质

摘要：蛋白质在细胞和生物体的生命活动过程中，起着十分重要的作用，是生命机体几乎所有重要活动的承担者。酵母菌应用于生物领域由来以久。6000年来人们用这种微小的真菌制作面包、啤酒和酒。现今用于直接治疗疾病的人类蛋白质的生产，已经成为一个每年有着190亿美元产值的产业。但是这种生物大分子目前却不能大批量的生产。它们大都是费时费力的从培养皿中培养的动物（如中国仓鼠）细胞分泌提取的。基因工程研究人员发现了一种用低等的酵母菌来生产人类蛋白质的新技术。这种技术开辟了一条大量生产生物药品的新途径。酵母菌能够用来生产复杂的人类糖蛋白，这种技术对于治疗用人类蛋白的生产有着革命性的意义。更好、更便宜、更快、更安全，并提供了一个对产品的最终质量进行控制的手段。作为宿主的酵母最常用的是毕赤氏酵母和酿酒酵母。 关键词：酵母菌;生产;蛋白质

Production of proteins using the yeast

Abstract: Protein in cells and organisms of biological processes, play an important role in almost

食品中蛋白质含量测定（凯氏定氮法）

一、实验目的

1.学习凯氏定氮法测定蛋白质的原理。

2.掌握凯氏定氮法的操作技术，包括样品的消化处理、蒸馏、滴定及蛋白质含量计算等。 二、实验原理

蛋白质是含氮的化合物。食品与浓硫酸和催化剂共同加热消化，使蛋白质分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，留在消化液中，然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再用盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量来乘以蛋白质换算系数，即得蛋白质含量。

因为食品中除蛋白质外，还含有其它含氮物质，所以此蛋白质称为粗蛋白。 1.消化：有机物中的胺根在强热和CuSO4/K2SO4，浓H2SO4 作用下，消化生成

（NH4）2SO4；

2NH3+H2S04+2H+=(NH4)2S04 （其中CuSO4做催化剂）

2.蒸馏：在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3，收集于H3BO3溶液中；

(NH4)2SO4+2NaOH=2NH3+2H2O+Na2SO4 2NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O

3.滴定：用已知浓度的HCl标准溶液滴定，根据HCI消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量。

(NH4)2B4O7

食品中蛋白质含量测定（凯氏定氮法）

一、实验目的

1.学习凯氏定氮法测定蛋白质的原理。

2.掌握凯氏定氮法的操作技术，包括样品的消化处理、蒸馏、滴定及蛋白质含量计算等。 二、实验原理

蛋白质是含氮的化合物。食品与浓硫酸和催化剂共同加热消化，使蛋白质分解，产生的氨与硫酸结合生成硫酸铵，留在消化液中，然后加碱蒸馏使氨游离，用硼酸吸收后，再用盐酸标准溶液滴定，根据酸的消耗量来乘以蛋白质换算系数，即得蛋白质含量。

因为食品中除蛋白质外，还含有其它含氮物质，所以此蛋白质称为粗蛋白。 1.消化：有机物中的胺根在强热和CuSO4/K2SO4，浓H2SO4 作用下，消化生成

（NH4）2SO4；

2NH3+H2S04+2H+=(NH4)2S04 （其中CuSO4做催化剂）

2.蒸馏：在凯氏定氮器中与碱作用，通过蒸馏释放出NH3，收集于H3BO3溶液中；

(NH4)2SO4+2NaOH=2NH3+2H2O+Na2SO4 2NH3+4H3BO3=(NH4)2B4O7+5H2O

3.滴定：用已知浓度的HCl标准溶液滴定，根据HCI消耗的量计算出氮的含量，然后乘以相应的换算因子，既得蛋白质的含量。

(NH4)2B4O7

采用3种方法对不同酵母菌的总DNA进行提取，经琼脂糖凝胶电泳、ND-1000型微量紫外分光光度计检测以及酶切、连接、预扩增试验结果的分析，表明采用改良氯化苄法提取酵母菌的总DNA质量最好，基本无DNA碎带，蛋白质污染小。通过对野生酵母菌菌株的验证试验，进一步证明采用改良氯化苄法提取的总DNA产量稳定、重复性好，可以直接用于限制性内切酶酶切试验，完全适于AFLP分析及一些其它分子生物学研究的要求方法三：酵母菌genomics/\基因组DNA的提取

一：仪器：同方法一

二：试剂：SE缓冲液（1M山梨醇，0.1MEDTA pH7.5）；溶菌酶（蛋白酶K缓冲液（10mM Tris pH7.6 0.5% SDS 1mM EDTA）；其余同前

三：操作

1.5ml 对数生长期细菌细胞

离心，12000rpm,1-2min

沉淀

溶于590ulSE缓冲液中混匀+10ul溶菌酶37℃,1hr

离心，12000rpm,8-10min

沉淀

溶于100μL，0.5μl蛋白酶Ｋ，混匀，37℃,1hr

加入1.2ml的CTAB

黄豆中蛋白质含量测定——凯氏定氮法

一、仪器和试剂 主要仪器:

定氮仪。

试剂（除注明外均为分析纯）： 1. 浓硫酸。

2. 30%氢氧化钠溶液。 3. 2～4%硼酸溶液。 4. 0.1mol/L盐酸溶液。

5. 催化剂：硫酸钾——硫酸铜的混合物（K2SO4:CuSO4·5H2O=3.5g:0.1g）。 二、操作步骤 1. 消化

准确称取粉碎均匀的黄豆粉0.5g左右，小心移入干燥的消化瓶中（注意用称量纸将样品加入到消化管底部，勿粘附在瓶壁上），加入适量催化剂及10mL浓硫酸，按要求安装好消化装置后,设置好消化程序,打开冷凝水, 开始消化程序。(160℃, 40min; 250℃, 20min; 350℃, 60min; 420℃, 30min)消化程序结束后，消化至溶液透明呈蓝绿色，冷却至室温。同时做空白对照。 2． 蒸馏、吸收及滴定

按要求安装好UDK142蒸馏仪，并将蒸馏仪与自动电位滴定仪连接好。将所需试剂装到相应的试剂瓶中。设置好蒸馏程序及滴定程序后，将冷却好的消化管装到蒸馏仪上，打开冷凝水，然后开始程序。 三、结果计算

X?(V1?V2)?c?0.0140?F?100mX ——试样中蛋白质的含量，单位为克每百克（g/100g） C

黄豆中蛋白质含量测定——凯氏定氮法

一、仪器和试剂 主要仪器:

定氮仪。

试剂（除注明外均为分析纯）： 1. 浓硫酸。

2. 30%氢氧化钠溶液。 3. 2～4%硼酸溶液。 4. 0.1mol/L盐酸溶液。

5. 催化剂：硫酸钾——硫酸铜的混合物（K2SO4:CuSO4·5H2O=3.5g:0.1g）。 二、操作步骤 1. 消化

准确称取粉碎均匀的黄豆粉0.5g左右，小心移入干燥的消化瓶中（注意用称量纸将样品加入到消化管底部，勿粘附在瓶壁上），加入适量催化剂及10mL浓硫酸，按要求安装好消化装置后,设置好消化程序,打开冷凝水, 开始消化程序。(160℃, 40min; 250℃, 20min; 350℃, 60min; 420℃, 30min)消化程序结束后，消化至溶液透明呈蓝绿色，冷却至室温。同时做空白对照。 2． 蒸馏、吸收及滴定

按要求安装好UDK142蒸馏仪，并将蒸馏仪与自动电位滴定仪连接好。将所需试剂装到相应的试剂瓶中。设置好蒸馏程序及滴定程序后，将冷却好的消化管装到蒸馏仪上，打开冷凝水，然后开始程序。 三、结果计算

X?(V1?V2)?c?0.0140?F?100mX ——试样中蛋白质的含量，单位为克每百克（g/100g） C

酵母DNA提取方法

方法一：

石英砂法

1、5000rpm×5min 收集过夜培养的菌体（5ml左右），于 200μL 裂解液(50 mmol/ L Tris-HCl pH 8.0 , 180 mmol/ LEDTA pH 8.0 , 1 % SDS , 现配)中，加入 3/10 总体积石英砂在涡流混合器上振荡 13min，每隔 4min 将离心管取出用力甩几下，然后 65℃水浴 10min。 2、加入 200μL 5mol/L KAc，冰浴 8min； 3、12000rpm×5min 转移上清至新的离心管中；

4、加入 3 mol/L NaAc 35μl，加入异丙醇 200μL混匀后冰浴 8min，12000rpm×5min收集沉淀；

5、200μL TE 溶解，加入 RNase10μL，65℃水浴 10min； 6、加入 200μL 氯仿－异戊醇（24:1）,抽提；

7、温柔地取上清 150μL ，加入 20μL 3 mol/L NaAc 及 375μL 无水乙醇，混匀后12000rpm×8min 收集 DNA；

8、70% 乙醇洗涤沉淀，吹干后 TE 溶解，-20℃保藏。

方法二：

蜗牛酶法

1. 接种于5 ml的YEPD培养基中在

实验八、蛋白质含量的测定

教学目的要求： 基本知识点

?1、掌握凯氏定氮法（Kjedahl法）测定蛋白质的原理、基本过程和操作关键。

?2、熟练消化、蒸馏、称量、过滤、定容、滴定等基本操技术。 ?3、掌握龙科－A型K氏定氮仪的操作方法 ?4、掌数据处理和结果计算技术。

重点

?1、熟练消化、蒸馏、称量、过滤、定容、滴定等基本操技术。 ?2、掌握龙科－A型K氏定氮仪的操作方法 难点

凯氏定氮法（Kjedahl法）测定蛋白质的原理、基本过程和操作关键。 课时教学方案： 复习与提问：

?1、检查实验准备情况，

?（1）实验内容；

?（2）实验仪器与试剂有哪些？

?（3）凯氏定氮法（Kjedahl法）测定蛋白质程序。 ?2、凯氏定氮法（Kjedahl法）测定蛋白质的原理。 ?3、样品消化时应注意的事项。

?4、龙科－A型K氏定氮仪的工作原理与蒸馏操作方法。

实验八、蛋白质含量的测定

一、实验目的

1、掌握凯氏定氮法测定蛋白质的原理；

2、熟悉凯氏定氮法中样品的消化、蒸馏、吸收等基本操作技能； 3、熟练称量、溶液转移、滴定等基本操作技能。 二、实验原理

食品与硫酸和催化剂一起加热消化，使蛋白质分解，其中C、H形成CO2

及H20逸去而氮以氨的形式与硫酸

班级：________________ 姓名：________________ 学号：________________ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _装_ _ _ _ _订_ _ _ _ _线_ _ _（装订线内禁止填写答案）_ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____

一、单项选择题,（在备选答案中只有一个是正确的）(本大题共100小题,100分)

1. 维系蛋白质α-螺旋和β-折叠结构稳定的化学键是

A.氢键 B.离子键 C.二硫键 D.疏水作用 E.肽键

(4)氨基酸的疏水侧链很少埋在蛋白质分子的内部 A.1,2,3 B.1,3 C.2,4 D.4 E.1,2,3,4

11. 在电场中，蛋白质泳动速度取决于

A.蛋白质颗粒的大小 B.蛋白质颗粒的形状 C.带净电荷的多少

D.A+C

E.蛋白质所带电荷的多少，分子量的大小

食物名称（50克） 热量（千卡） 蛋白质（克）

蛋类：

鹌鹑蛋 80 6.4 鸡蛋（红皮） 78 6.35 鸡蛋白 30 5.8 鸡蛋黄 164 7.6 松花蛋（鸡蛋） 89 7.4 鸭蛋 90 6.3 松花蛋（鸭蛋） 85.5 7.1 鹅蛋 豆腐 大豆（黄豆） 腐竹 豆腐脑 素鸡