药理实验方法学徐淑云

第一章 现代药理学实验方法与技术简介

第一节 分子生物学试验方法与技术

分子生物技术在药理学实验中应用较为广泛，包括核酸分子探针的标记、核酸分子杂交、多聚酶链反应、蛋白印迹杂交技术、cDNA文库、随机分子库技术、外核基因在真核细胞中的表达、转基因动物、人类基因治疗等。现将更为常用的技术介绍如下：

一、核酸分子探针的标记 标记核酸分子探针（nucleic acid probe）是进行核杂交的基础，根据核酸分子探针的来源及性质进行选择，选择的基本原则是具有高度的特异性，探针选择直接影响杂交结果的分析。根据检测对象和目的不同，，可选择不同的探针种类及标记方法。

㈠ 探针种类

1．基因组DNA探针 是克隆化的各种基因片断，也是最常用的核酸探针，探针应尽可能选用基因编码（外显子），避免使用内含子及其它非编码序列。

2．cDNA探针 与mRNA互补的DNA链称cDNA，是一种较为理想的核酸探针，特异性较高。

3．RNA探针 RNA与RNA或DNA杂交体的探针稳定性，特异性高。 4．寡核苷酸探针 人工合成寡核苷酸片段做探针，可根据需要合成相应序列。

㈡ 标记物

常用的探针标记物有两类：放射性同位素和非放射性同位素。标记物的检测

Western blot 实验

1、试剂配制： （一）母液

1.0mol/L Tris·HCl

Tris (MW121.14) 12.12g 蒸馏水 50ml

溶解后，用浓盐酸调pH至6.8（见下所示），最后用蒸馏水定容至100ml，室温下保存。 注：PH ： 6.8 约需22ml浓盐酸

10％ SDS

SDS 10g

蒸馏水定容至 100ml

50℃水浴下溶解，室温保存。如在长期保存中出现沉淀，水浴溶化后，仍可使用。

10％过硫酸胺（AP） 过硫酸胺 0.1g 超纯水 1.0ml

溶解后，4℃保存，保存时间为1周，最好现配先用。

1.5mol/L Tris·HCl（pH8.8） Tris 18.2g

蒸馏水 50ml

溶解后，用浓盐酸调pH至8.8，最后用蒸馏水定容至100ml，室温下保存。

30％Acr/Bic（29：1

临床研究设计复习知识点梳理

一、临床研究设计：概要介绍及观察性研究

1. 临床研究设计中需要把握什么基本原则，在实施阶段哪些环节可能导致研究偏离这些原则？ （1）根据研究目的选择适宜的研究类型：

描述性 不预先选定，而是在完成数据收集后进行事后比较。 分析性 预先确定要比较的研究对象分组 人群研究 生态学研究 以群体为调查对象 横断面研究 以个体为调查对象 队列研究 根据病因情况分组 社区干预试验 干预措施针对群体 现场试验 干预措施针对个体 临床研究 横断面研究 以个体为调查对象 病例对照研究 根据危险因素情况分组 队列研究 根据病因情况分组 医院干预试验 干预措施针对群体 临床试验 干预措施针对个体 观察法 不施加干预 实验法 施加干预 （2）代表性和可比性是确保不同类型研究结果可靠的核心原则【目的不同，要求不同】： ①情况描述——生态学研究、横断面调查和监测

代表性：以调查样本分布推而广之了解总体的分布，数据代表范围越大越好 a.普查：代表性最强，但是由于成本过高和实施过程太难，因此很少使用；

b.随机抽样：遵循随机化原则，保证总体中每一个调查对象都有已知机会被选入作为研究对象。五种基本形式：简单随机抽样、等距抽样、类型抽样、

★脾细胞保存方法

（一）短期保存技术

适用范围：术后1周PRT反应。

保存方法：将分离到的细胞用适量含10％～20％灭活小牛血清的RPMI1640培养液稀释重悬。置4℃保存较好，可减低细胞代谢活动。要注意不要迅速改变细胞所处的温度，以免造成细胞“温度”休克。保存1管即可。 （二）长期冷冻保存技术

适用范围：术后2周以后的PRT反应。 保存方法：利用液氮深低温（－196℃）环境保存细胞，冷冻时的降温速度和细胞解冻时的升温速度对细胞活力的保存有很大影响。低速离心后，取沉积细胞用含10％二甲亚砜的小牛血清配制成适当浓度的细胞悬液，分装于冻存管内（保存3管），速即放入降温过渡站中，避免二甲亚砜对细胞的损伤。用两步降温法，即迅速降温至－80℃低温冰箱过夜，或在液氮罐液面以上的一层空间放置片刻，然后再放入液氮中。如需复苏细胞，则需迅速解冻以恢复细胞的活力，要求在20s以内完全融化。将冻存管自液氮中取出，立即放入40℃温水中，融化后即从水中取出，吸出细胞悬液，加入10倍的培养液中混匀，继而低速离心，尽快洗去保护剂，再悬于新培养液中，计数并检查细胞活力，然后置37℃培养箱内培养。

★相关试剂的配制

（一）PBS：800ml蒸馏水中，溶解8克N

实验一 准备实验（一）

分光光度计的使用

一. 目的

通过电化教学方式学习分光光度计的工作原理 掌握比色测定的基本操作方法

二. 原理

光线的本质是电磁波的一种，有不同的波长。肉眼可见的彩色光称为可见光，波长范围在400～750nm：小于400nm的光线称为紫外光；大于750nm的光线称为红外光。

当光线通过透明溶液介质时，其辐射的波长有一部分被吸收，一部分透过、因此光线射出溶液之后，部分光波减少，这种光波的吸收和透过可用于某些物质的定性定量分析。

LI0CI分光光度法依据Lambert-Beer定律：lg令A = lgI0II0I = KCL

，T =

II0，则A = KCL，A = -lgT

A：吸光度（有时用光密度OD表示） I0：入射光强度 L：溶液的光径长度

其中：T：透光率 I： 透射光强度 K：吸收系数 C：溶液的浓度

从上式可以看出，一束单色光通过溶液后，光波被吸收一部分，其吸收多少与溶液中溶质的浓度和溶液厚度成正比，当入射光、吸收系数K和溶液的光径长度L不变时，吸光度A与溶液的浓度C成正比。

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三. 实验材料及设备

1. 仪器

分光光度计 放相

一、土壤有机碳测定

实验方法：重铬酸钾容量法——外加热法

仪器：油浴消化装置、矿物油或植物油、可调温电炉、分析天平（感应量0.0001g）、硬质试管、温度计（0~300℃）、酸式滴定管、三角瓶（250ml）、小漏斗 试剂：0.8mol·L-1（1/6K2Cr2O7）标准溶液、浓硫酸（分析纯）、0.2mol·L-1FeSO4溶液、0.1mol·L-1（1/6K2Cr2O7）标准溶液、邻菲罗啉指示剂

二、土壤全氮量测定

实验方法：凯氏定氮法

仪器：消化炉、消化管、分析天平（感量0.0001g）、凯氏定氮仪 试剂：浓硫酸、混合催化剂、40%NaOH溶液、硼酸指示剂

三、土壤有效性氮测定

实验方法：扩散吸收法

仪器：半微量滴定管（5ml）、扩散皿

试剂：1.8mol·L-1氢氧化钠溶液（适用于旱地土壤）、1.2mol·L-1氢氧化钠溶液（适用于水稻土）、2%硼酸溶液、0.01mol·L-1盐酸溶液、特制胶水（阿拉伯胶）、硫酸亚铁（粉状）

四、土壤全磷量测定

实验方法：HClO4—H2SO4消煮法

仪器：分析天平、开氏瓶或消化管、小漏斗、电炉、三角瓶、移液管、比色杯、容量瓶、分光光度计

试剂：浓硫酸、70%~72%高氯酸、2,6-二硝基酚或2,4

转染实验方案

1. LB培养基的配制：500ml（5皿+2锥形瓶）

准备：500ml玻璃瓶1个，250ml玻璃瓶2个，500ml容量瓶一个，平皿5个 称取：酵母浸提液 5.0g 蛋白胨 10.0g 氯化钠 10.0g 实验操作：

混合后加去离子水（或注射用水）水400ml，待充分溶解后加水定容至500ml，取100ml做固体培养基用装入A瓶，余下装入500ml B瓶中（400ml/瓶） 称取1.5g琼脂粉加入A瓶中

另取一瓶（C瓶）接100ml水（稀释氨苄西林用） 将以上3瓶高压灭菌：121°C , 30min 取氨苄西林一支：规格：1g/支

加水于安瓶中溶解后，移入C瓶中，浓度：10mg/ml 按照50μg/ml氨苄西林的浓度加到A B C三瓶中

A瓶：0.5ml（即为LB固体培养基）——松弛型100μg/ml,严紧型50μg/ml B瓶：2ml（即为LB液体培养基）

将A瓶按20ml/平皿，分别移到5个平皿中，待冷却后即为固体培养基。 用膜封口放入4℃保存。

2. 感受态转化与培养（TOP10）

准备：37℃摇床，37℃烘箱，10cm培养皿（LB琼脂凝胶+氨苄=50 ml LB+0.75 g琼脂+50μl氨苄），冰盒，

注意 : 氯化納溶於水, 酚酞只溶於酒精

鹽水濃度為0.2% ( 請用 分析純-氯化納)

並滴入適量的3%酚酞酒精溶液指示劑

酚酞酒精溶液 適量滴入 鹽水 的比例 GB國標沒說明清楚

漆包线针孔测试方法

1.取6米不弯曲未拉长试料,将其浸入3%酚酞酒精+0.2%食盐溶液中,以溶液为正极,以试料为负极施加DC 12V直流电一分钟,然后数针孔即可(有针孔的地方会有红色气泡冒出),针孔数在8PCS以下即为合格.

2.一般方法如下:

把0.06mm的铜线取出1.5m,0.07mm以上的铜线取出6m,然后在规定的温度下(没有规定温度的话,按122~128度)恒温里放入加热10分钟,加热时不得弯曲,不得拉伸.

再把0.06mm,以下的铜线取出1m,0.07mm以上的铜线取出5m,放入有0.2%的食盐水里倒有3%的Phenol pathalein的酒精,在加12V的直流电压加1分钟后确认其是否有针孔;

溶液的配比方法:

0.2%食盐水(例如:99.8g的水,2g盐)

3%酚酞溶液(例如:20g的纯酒精,6g酚酞)

浴液使用硫酸钠溶液，酚酞作为指示剂

如果漆包线上有针孔，那么针孔处就会发生电解反应，生成H2和OH-

酚酞遇OH-变红，就可以指示一个针孔了。

盐水针孔试验法作用探讨----

农业非点源污染

农业非点源污染数据采集方法一： 采样准备 1、 采样安排

a) 水样的采集与监测项目的确定。

确定采集水样的位置，能够反映非点源污染的特征。同时，人力能够到的地方，而且监测指标能够反映非点源污染的特点。 b) 采样时间、采样频率的安排

为了更好的了解污染物的年间变化，在11年和12年，原则上应以月单位进行水样采集，一旦出现天气突变情况，随时根据情况调整时间。

c) 除了特殊实验目的外（如研究雨季连续降雨），应当尽量排除前一场降雨对实验的影响，以免造成实验数据分析的困难。 由于目前还无法实现自动采样，所有水样都依靠人工进行采集。在实验过程中，根据实验情况调整采样时间，采样频率。 2、 采样点的空间设置

为了研究污染物的空间变化，本次研究选择的土地类型包括：水田，旱田，居民点，草地等。实验的水质采样点根据小流域的出口入口及土地利用类型等水污染影响因素确定。利用GPS定点采集水样。 3、 实验方法

由于氮、磷是农业面源污染的重要原因，所以应利用GPS定点

采样，N、P、COD、BOD等。每项测定方法： a) 总氮： b) 总磷： c) COD： d) BOD： e) ……

农业非点源污染数据采集方法二：

SWAT模型需要输入主要农作物

实验1 《科达组装电脑管理信息系统》 一、上机实验目的

1. 了解使用数据库开发一个小型信息系统的过程。 2. 掌握使用Access 数据库保存数据、按用户要求对数据进行处理，通过友好界面输出信息报告的方法。

3. 掌握Access 数据库查询、统计、输出等功能。

4. 通过实验理解数据库知识、软件开发工具知识和管理信息系统知识，了解如何将它们融会贯通起来为解决实际应用问题服务。

二、上机实验基本要求

1. 在规定上机时间内完成信息系统的开发任务，由指导老师检查通过。 2. 按时提交上机实验报告。

3. 指出系统的创新之处（学生要说明系统的创新点及意义）。

三、开发系统资料

（一）公司基本情况

科达电脑公司现在是一个销售电脑外部设备和组装电脑的小公司，成长很快。该公司成立于1997 年，由于销售量增长很快，公司考虑扩展其业务。

公司目前推出5 种型号的计算机：入门级PC、家用PC、小企业PC、高能PC 和超强PC。公司采用标准配件组装这些计算机，其中一些配件如键盘、鼠标、主板及电源对所有型号的计算机都是一样的。另外一些配件象CPU，不同型号的计算机有不同的配置，入门级和家用PC 使用的是Celeron 系列产品，而其它型号则使用不同速度的Pe