农杆菌介导的遗传转化实验

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以55个大豆基因型未成熟子叶为外植体,用高浓度2,4-D诱导大豆体细胞胚胎发生与植株再生,并对生产上种植面积大、体细胞胚胎发生率高的大豆基因型用农杆菌介导法进行遗传转化。结果表明,东北地区主栽的大豆基因型中有14个基因型体细胞胚胎发生率超过40%。用含有pGBI121S4ABC

遗!传!!"#"#"$%&’(!)*++-!"#"$#!%&&$!&&’,."

研究报告

大豆体细胞胚胎发生与农杆菌介导的遗传转化

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王!萍*!!王!罡!!!季!静!!!曾凡亭(!黄彬城(!曹!江(!吴!颖(

!哈尔滨*天津(*O黑龙江省农业科学院博士后工作站$#&&+")!O天津大学农业与生物工程学院$&&&%!)

长春*"(O解放军军需大学植物基因工程研究中心植物分子生物学研究室$(&&"!

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13（5）：789-797植物遗传资源学报2012，

JournalofPlantGeneticResources

农杆菌介导的大豆子叶节非组织

培养遗传转化体系优化

李丹丹，张

洁，刘

娜，陈

琰，韩胜芳，王冬梅

（河北农业大学生命科学学院，保定071001）

摘要：本研究以GUS基因在子叶节区的瞬时表达为依据，通过探讨影响农杆菌转化效率的因素，优化了大豆子叶节非组织培养遗传转化体系；利用该体系对冀豆16号进行Bar基因的遗传转化，并使用针刺法对转基因植株进行草铵膦筛选。结果OD600=0.6、77、表明，侵染液中附加3%蔗糖、以脱脂棉作为菌液附着介质同时不添加表面活性剂SilwetL-侵染1次的GUS阳PCR鉴定共获转化率为2.5%。经PCR和RT-性率最高达到62.13%。草铵膦抗性植株经PCR检测获得T0阳性植株10个，得3株T1阳性植株，初步证明目的基因已整合到大豆基因组中。

关键词：大豆；子叶节；非组织培养；遗传转化；草铵膦筛选

OptimizationoftheAgrobacterium-MediatedGeneticTransformation

SystemofSoybeanCotyledonaryNodeWithNonTissue-Culture

农杆菌感受态制备

1、划平板，单克隆培养

2、挑单克隆于5ML LB培养基中，摇到饱和（1-2day） 3、50m离心管中4500rpm，15min

4、50ml菌体用1ml氯化钙（预冷）悬浮，冰上操作 5、每100ul分装于冷冻管中，液氮速冻后，-70℃保存

农杆菌转化

1．50ul感受态+5ul质粒，放入液氮速冻2min 2．37℃ 热激5min

3. 加1mlLB，28℃培养3-4h

3. 8000rpm/min去上清，200ulLB悬浮，涂板吹干 农杆菌抗性：利福平+庆大霉素+载体抗性。（GV3101） 庆大霉素 40mg/ml （0.4g/10ml）；利福平 50mg/ml DMSO溶解 200ml LB + 200ul母液

农杆菌转植物

1. 植物去顶三天后转化，转前一天交足水

2. 摇菌OD600=1.2~1.6 （先小摇后，取200ul大摇200ml）

3. 室温5000rpm，15min，弃上清，悬浮于等体积渗透培养基中 （200ml/转化） 每1000ml渗透培养基：1/2 MS 2.42g；蔗糖50g；MES 0.5g；用1M KOH调PH到5.8/5.7，定容到1000ml，加10ul 1mg/ml6-BA，加200

感受态制备

A 大肠杆菌感受态的制备（CaCl2法）（《水稻NR和NIR基因启动子的克隆及功能验证》第38页）

1 材料、设备及试剂

1.1 材料

大肠杆菌DH5α、BL21、Rossette、JM109菌株

1.2试剂

LB液体培养基：

蛋白胨 10g/L

酵母提取物 5g/L

NaCl 10g/L

NaOH（1mol/L） 1mL/L

400mL 0.1M/L预冷的 CaCl2溶液（高温高压灭菌）

50%甘油

75%酒精

95%酒精

液氮

1.3 实验设备

接种环、酒精灯，打火机，75%酒精，95%酒精，50mL灭菌三角瓶4个，250mL灭菌的三角瓶4个，移液抢（5mL、200μL，1000μL），灭菌的枪头（5mL、200μL，1000μL），离心管（1.5mL，50mL）恒温摇床,灭菌锅，紫外分光光度计，超净工作台，制冰机，冰盒，高速冷冻离心机。

2 实验步骤

1、从新鲜培养的大肠杆菌DH5α平板上挑取一个单菌落，接种于5mL新鲜LB培液体养基中，于37℃，200rpm振荡培养过夜。

2、培养1

感受态制备

A 大肠杆菌感受态的制备（CaCl2法）（《水稻NR和NIR基因启动子的克隆及功能验证》第38页）

1 材料、设备及试剂

1.1 材料

大肠杆菌DH5α、BL21、Rossette、JM109菌株

1.2试剂

LB液体培养基：

蛋白胨 10g/L

酵母提取物 5g/L

NaCl 10g/L

NaOH（1mol/L） 1mL/L

400mL 0.1M/L预冷的 CaCl2溶液（高温高压灭菌）

50%甘油

75%酒精

95%酒精

液氮

1.3 实验设备

接种环、酒精灯，打火机，75%酒精，95%酒精，50mL灭菌三角瓶4个，250mL灭菌的三角瓶4个，移液抢（5mL、200μL，1000μL），灭菌的枪头（5mL、200μL，1000μL），离心管（1.5mL，50mL）恒温摇床,灭菌锅，紫外分光光度计，超净工作台，制冰机，冰盒，高速冷冻离心机。

2 实验步骤

1、从新鲜培养的大肠杆菌DH5α平板上挑取一个单菌落，接种于5mL新鲜LB培液体养基中，于37℃，200rpm振荡培养过夜。

2、培养1

EHA101农杆菌感受态细胞 编码 北京华越洋生物WXR15-100S 北京华越洋生物WWXR115-100 产名称 EHA101农杆菌感受态细胞 EHA101农杆菌感受态细胞 单位 规格 盒 盒 10*100ul 20*100ul

EHA101农杆菌感受态细胞

EHA101 Chemically Competent Cell 产品说明书 产品规格

EHA101: 10×100 μl

pK7WGF2 (control vector) 10 ng/μl 10 μl

保存条件： -80℃ 基因型

C58 (rif R) Ti pEHA101 (pTiBo542 D T-DNA) (kanR, strepR) Nopaline

EHA101农杆菌感受态细胞说明

华越洋 EHA101菌株为C58型背景，核基因中含有筛选标签——利福平抗性基因rif，为了便于转化操作，此菌株携带一无自身转运功能的胭脂碱型Ti质粒pEHA101 (pTiBo542DT-DNA)，此质粒含有vir基因 (vir基因是T-DNA插入植物基因组必需的元件，pEHA101

篇一：实验1 大肠杆菌的培养和分离实验教学提纲

实验1 大肠杆菌的培养和分离教学提纲

实验目的

1. 进行大肠杆菌的扩增，利用液体培养基进行细菌培养的操作。

2. 进行大肠杆菌的分离，用固体培养基进行细菌的划线培养。

3. 说明大肠杆菌的培养条件和操作要求的原理。

实验材料

1. 配制LB液体培养基，蛋白胨0.5g，酵母提取液0.25g，氯化钠0.5g，加水50mL溶解。

2. 配制LB固体培养基，蛋白胨0.5g，酵母提取液0.25g，氯化钠0.5g，琼脂1g，加水50mL溶解（配制LB固体培养基是用来倒平板和倒试管斜面）。

实验步骤

1. 培养基灭菌。

在两个150mL的三角瓶中分别装入50mL LB液体培养基和50mL LB固体培养基（刚配好，尚未凝固），加上封口膜(一种塑料薄膜，中间有小孔的滤膜。既可以通气，又不使细菌进入。)。将培养皿用牛皮纸包好，放入高压灭菌锅中，1kg压力灭菌15min（有压力时开始计时）。 同时将需要灭菌使用的培养皿、试管、三角瓶等和所用器械（接种环、镊子等）等一块灭菌。

2. 倒平板，倒斜面。

灭菌后。待高压锅压力与大气压相同时，打开锅盖，将有培养基的三角瓶、试管、培养皿等放在灭菌后的超净工作台上。

超净工作台操作：打超净工作台的紫外

大肠杆菌的培养

1. LB培养基配制： （液体培养基） ① 取1L的烧杯，加入适量的一蒸水（＜1000ml），称取胰蛋白胨 10g , 酵母提取物 5g , Nacl 10 g 倒入烧杯中

② 加入磁子搅拌，至完全溶解 ③ 用NaoH调PH=7.0，定容至1L ④ 分装后高压蒸汽灭菌 （固体培养基） ① 在液体培养基的基础上加入琼脂糖：1L液体培养基→15g琼脂糖（用水先溶解） ② 在电炉子上边加热边搅拌至煮沸溶解 ③ 分装后高压灭菌

抗生素的加入温度要求：高压灭菌后，将融化的LB固体培养基置与55℃的水浴中，待培养基温度降到55℃时（手可触摸）加入抗生素，以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。 注意事项：

① 电炉子温度不要太高，烧杯直接加热时电炉子上要加石棉网 高压灭菌时，瓶盖上要插上针头，防止灭菌时瓶盖喷出 2. 倒平板：

培养皿要提前进行灭菌、烘干，在超净工作台里，打开酒精灯，在酒精灯的火焰旁进行操作，倒完后做好标记

3. 接种（平板划线分离法）：

接种环挑取大肠杆菌进行接种：图式：

注意：每次划线前接种环都要灼烧灭菌，再冷却。 4. 37°恒温培养箱培养：

接种好的培养皿正置15分钟，然后倒置放入培养箱过夜培养

倒置培养原因：恒温

3.大肠杆菌电转化及电转感受态细胞的制备

电转化法是利用瞬间高压在细胞上打孔，同时，DNA在电场力的作用下进入细胞，随后

细胞复苏和弥合，从而实现质粒DNA的物理转移。为避免电击时出现“击穿”，即产生电

910

流，细胞悬浮液中应含有尽量少的导电离子。转化效率为10～10转化子/μg DNA。

3.1．感受态细胞的制备

（1）感受态细胞及材料准备同钙转化感受态细胞的制备相同。

（2）选合适的大肠杆菌在4℃，3000 rpm下离心10min，弃上清液（如需要，沉淀可在

4℃的10%甘油中保存1～2天）。

（3）弃上清，离心管中加入少量ddH2O，轻柔的悬浮沉淀后，再将水注满离心杯，4℃，3000

rpm离心10min。

（4）重复步骤（3）1次。

（5）小心弃上清（沉淀可能会很松散），再往离心管中加入少量10%甘油（灭菌，预冷），重悬菌体，再加满10%甘油，4℃，4000 rpm离心10min。

（6）用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2～3ml，将细胞按200μl等份装入微量离心管，放置于－80℃下保存。

（7）按照钙转化感受态细胞方法进行转化效率和抗性检测。

3.2．电转化

为了降低离子浓度，待转化的质粒