液氮冻存组织

常用字生物标本处理办法

一般的生物标本包括有：

血液、体液、内脏器官、粪便、胃液、活检组织、组织提取液、天然孔分泌物及各种表达系统的表达产物等

一般为无菌操作，低温保存（-80℃、液氮）

一．如果采集的实质器官则要求： 1、 器官实质不能太小

2、 以采集实质性病灶区为佳：如淋巴结、心脏、非、肺、脾以及肠管等病毒、病菌聚集的

地方为佳

3、 同一病例装入同一容器，并做好标记 4、 应在0-8℃的低温储存和运输 5、 实质性器官的处理：

5.1、取实质性器官约0.5mg左右，充分剪碎或研磨 5.2、加入约500ml的PBS/生理盐水，充分混匀 5.3、离心5000rmp x10min，去上清

5.4、-20℃保存，作为待检标本（切勿反复冻融）

二．体液（常见的包括血清、血浆、唾液以及尿液等）的处理方式

1、血液包括血浆和血清，它们的主要区别就是：血清凝血而血浆不凝血，所以它们的处理方式也就不一样

1.1、采集血浆时一般不加抗凝剂（主要为枸橼酸眼和柠檬酸盐），采集后立即离心800-1000rmp x 5min分离，取上清，-20℃或4℃保存备用；

1.2、如要采集血清，一般要加入总体积1%的抗凝剂，采集后先室温或4℃静置半小时后，800-10

常用字生物标本处理办法

一般的生物标本包括有：

血液、体液、内脏器官、粪便、胃液、活检组织、组织提取液、天然孔分泌物及各种表达系统的表达产物等

一般为无菌操作，低温保存（-80℃、液氮）

一．如果采集的实质器官则要求： 1、 器官实质不能太小

2、 以采集实质性病灶区为佳：如淋巴结、心脏、非、肺、脾以及肠管等病毒、病菌聚集的

地方为佳

3、 同一病例装入同一容器，并做好标记 4、 应在0-8℃的低温储存和运输 5、 实质性器官的处理：

5.1、取实质性器官约0.5mg左右，充分剪碎或研磨 5.2、加入约500ml的PBS/生理盐水，充分混匀 5.3、离心5000rmp x10min，去上清

5.4、-20℃保存，作为待检标本（切勿反复冻融）

二．体液（常见的包括血清、血浆、唾液以及尿液等）的处理方式

1、血液包括血浆和血清，它们的主要区别就是：血清凝血而血浆不凝血，所以它们的处理方式也就不一样

1.1、采集血浆时一般不加抗凝剂（主要为枸橼酸眼和柠檬酸盐），采集后立即离心800-1000rmp x 5min分离，取上清，-20℃或4℃保存备用；

1.2、如要采集血清，一般要加入总体积1%的抗凝剂，采集后先室温或4℃静置半小时后，800-10

甘油、DMSO细胞冻存液冻存效果的比较实验研究

【摘 要】目的采用两种不同的细胞冻存液对Vero细胞的冻存效果进行研究。方法 本实验主要研究甘油和二甲基亚砜这两种细胞冷冻保护剂，以及他们与血清、基础培养基的不同配比与细胞冻存效果之间的关系。 结果发现不同的细胞冻存液在一定的所占比例内与细胞复苏后的成活率有一定的相关性，即在一定比例的冷冻剂保护下，细胞冻存的效果才会达到最佳。结论保护剂，无论是DMSO，还是甘油，其比例只有在10%-15%之间，细胞复苏后的成活率才达到最佳状态，即有利于细胞的冻存。且冷冻解冻后的细胞呈现正常的分裂增殖生长模式。

【关键词】DMSO；甘油；Vero细胞；细胞冻存

细胞培养是研究活组织和活细胞的良好方法。长期传代势必会影响细胞对微生物及一些有害有毒物质没有抵抗能力，也会造成资源浪费[1]。目前最常用的细胞冻存剂是DMSO和甘油，因此本实验主要研究这两种冷冻保护剂对细胞冻存效果的比较。本研究以DMEM为细胞培养液， 以DMSO或甘油作为冷冻保护剂，并添加胎牛血清组成冷冻保护液[2-3]，通过两种冻存液的不同配方及其不同配比对细胞冻存效果的比较采取最佳冷冻保护剂的比例将细胞冻存，为以后的工作提供更多便利，同时也节省了大

细胞的冻存

细胞深低温保存的基本原理是：在－70℃以下时，细胞内的酶活性均己停止，即代谢处于完全停止状态，故可以长期保存。细胞低温保存的关键，在于通过0~20℃阶段的处理过程。在此温度范围内，水晶呈针状，极易招致细胞的严重损伤。 总的原则是缓慢冻存！！！ 一 材料：

生长良好之培养细胞，新鲜培养基，DMSO，无菌塑料冷冻保存管，血球计数盘与盖玻片。

二步骤：

2.1 冷冻前一日前更换半量或全量培养基，观察细胞生长情形，最好细胞应该处于对数生长期。 2.2. 配制冷冻保存溶液(使用前配制)：将DMSO加入新鲜培养基中，最后浓度为5–10％，混合均匀，置于室温下待用。避免因临时配制产热而伤害细胞。

2.3. 依细胞继代培养之操作，收集培养之细胞与冻存管内，取少量细胞悬浮液(约0.1 mL)计数细胞浓度。

2.4. 先将冻存管放入4℃冰箱，约40min。

2.5 接着置于–20℃冰箱，约30–60min。20 °C 不可超过1 小时， 以防止冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入–80°C 冰箱中，惟存活率稍微降低一些。 2.6. 置于–80超低温冰箱中放置过夜。 2.7. 置于液氮罐中长期保存。

2.8 同时做好冻存记录，在自己的笔

细胞冻存与复苏

细胞储存在液氮中，温度达-196℃，理论上储存时间是无限的。细胞冻存及复苏的基本原则是慢冻快融，实验证明这样可以最大限度的保存细胞活力。

细胞的冻存 【用品】

（1） 5%胰蛋白酶

（2） 含10%~20%血清培养液

（3） DMSO（分析纯）或无色新鲜甘油（15磅蒸汽高压消毒） （4） 吸管、离心管、冻存管 【步骤】

（1） 从增殖期到形成致密的单层细胞以前的培养细胞都可以用于冻存，但最好为对数生长期细胞，已经长满的细胞冻存后生存率低。在冻存前一天最好换一次培养液。

（2） 用胰蛋白酶把单层生长的细胞消化下来，悬浮生长的细胞则不需处理。依据传代方法把消化好的细胞收集于离心管并计数，离心。

（3） 去除胰蛋白酶及旧的培养液，加入配制好的冻存培养液（含10%DMSO或甘油），冻存液中细胞的最终密度为5×106/ml~1×107/ml。用吸管轻轻吹打使细胞均匀，然后分装入无菌冻存管中。

（4） 装完细胞后的冻存管即可直接冻存。以本教研室对L929的冻存程序作为大家进行细胞冻存的参考：将冻存管放入4℃冰箱 2hr；-20℃冰箱2hr；液氮表面过夜。以后取出冻存管移入液氮容器内。在放入液氮时，要带手套操作以免冻伤。

液氮研磨组织提取RNA步骤

一、试剂与耗材（RNA提取专用，无RNase）

75%的酒精（用无酶水配制），RNase Zap， Trizol(Invitrogen)，氯仿，异丙醇，无RNA酶水（Ambion）；研钵，研杵，1.5ml EP管，2.0ml EP管，15ml 管，50ml 管，棉纱布。 二、操作步骤

1) 用75%酒精对实验操作台、移液枪、枪头盒、管架进行消毒，然后再用RNase Zap擦拭上述材料。

2) 取出-80℃冰箱保存的组织块，放于用液氮预冷过的研钵中，敲碎一小块组织，其余放回冻存管。

3) 加入液氮，先轻轻敲碎组织到最小块，再研磨成粉末，直到看不到组织块。

4) 加入液氮使粉末凝聚成团，马上用药勺把粉末转移到2.0ml EP管中。

5) 待液氮挥发干后，加入1ml Trizol裂解液，用1ml移液器将细胞吹散开，保证细胞裂解充分，必要时可借助水平振荡器混匀。 6) 4℃离心机12000rpm离心5分钟,弃沉淀。注：此时可放入-80℃低温冰箱长期保存。

7) 加入氯仿，比例200ul氯仿/ml Trizol，颠倒混匀，室温放置15分钟。

8) 于4℃离心机12000g离心15分钟。取上清液（上层为水相，中间层为蛋白，下层

围绕siRNAs的相关实验详细步骤及总结

实验一：细胞传代培养

材料：15ml离心管、枪（头1ml、200ul、10ul）、无菌吸管、培养瓶、含10?S的RPMI—1640(OVCAR-3)、M5A(SKOV-3)、PBS、trypsin等

步骤：（以下均在超净台内，酒精灯旁操作）（SKOV-3）

1、打开超净台，将离心管、枪（头）、吸管等工具置于紫外线下照射30min；含10?S的RPMI—1640、trypsin、PBS放在37°C水浴恒温箱中预热。

2、取一个生长良好的细胞培养瓶（密度适中，细胞成梭形连接，贴壁良好），弃旧培养基，PBS 2ml 清洗2次（切勿用力吹打）。

3、用移液枪取trypsin 1ml沿细胞生长壁对侧壁注入，然后放平培养瓶，使贴壁细胞与trypsin充分接触，置于CO2培养箱2min左右（时间不能太长，以免损伤细胞）。

4、往培养瓶中加入1640 1~2ml，随后用移液枪将悬液移到15ml离心管中，离心1000 r/min，5min。

5、弃上清液，加入少量10?S的1640培养基使成细胞悬液。

6、分装，按1:2~3传代，每瓶4~5ml。倒置显微镜下观察（细胞突起消失变圆

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技术参数：

直径 20 in. (508mm) 高度 69 7/16 in. (1764mm) 空重（标定） 287 lb. (130 kg) 最大液体容量 208 liters 可用液体容量 198 liters 正常蒸发率 / 天 氧：1.2%、氮：1.9%、氩：1.2%、二氧化碳：0.75%、氧化氮：0.75% 气体输送率 氧：350 cfh (9.2 cu. m/h)、氮：350 cfh (9.2 cu. m/h)、氩：350 cfh (9.2 cu. m/h)、二氧化碳：150 cfh (3.9 cu. m/h)、氧化氮：110 cfh (2.9 cu. m/h) 增压器设定值 300 psig(20

一，更换氨气气瓶操作

（1）首先缓慢打开备用瓶C阀门,检查是否有漏气。（2）确认没问题后打开连接备用瓶的A管道阀门

（3）同时关闭正在开启使用的气瓶上的D阀门   （4）关闭即将更换钢瓶的D阀门

二，吊移钢瓶注意点

（1）起吊钢瓶注意保持钢丝绳始终垂直⊥，以免损坏吊机排线器。

（2）注意吊移过程中控制瓶体摆动幅度，以免发生撞击等安全事故。

三，钢瓶管道连接

（1）钢丝编织网软管与钢瓶连接必须在连接螺帽内加四氟垫片并紧固螺帽避免漏气

（2）需保证链接完成后软管无打结现象。

（3）最后检查各阀门开闭是否正常

液氮洗工段操作问答

1、液氮洗系统的生产任务是什么？

答：

液氮系统的主要生产任务有：

1）净化原料气：

利用分子筛吸附器脱除来自低温甲醇洗工艺气中的微量CO

2、CH3OH等高沸点物质。

利用液氮洗涤脱除工艺气中对氨合成触媒有害作用的微量CO及CH

4、Ar等惰性气，制取CO<5ppm的净化气。

2）配氮

根据氨合成系统的需要，向出系统的合成气中配入高压氮气，调节合成气的氢氮比（理论值3：1），作为生产合成氨的原料。

3）回收CO、CH4等可燃性气体，供燃料气系统作为燃料气。

4）回收氮洗塔底尾液中H2，送往K401压缩回收利用。

5）调整冷量平衡，为低温甲醇洗工段提供冷量。

2、什么叫吸附？吸附与解吸时热量如何变化？

答：

吸附是指两种相态不同的物质接触时，其中密度较低物质的分子在密度较高的物质表面被富集的现象和过程。

具有吸附作用的物质（一般为密度相对较大的多孔固体）被成为吸附剂，被吸附的物质（一般为密度相对较小的气体或液体）称为吸附质。

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我们通常所说的气体的吸附是指气体与多孔性固体接触时，气体中的一种或几种组份附着在固体表面的现象。其中多孔性固体称为吸附剂，被吸附的气体组份称为吸附质。气体的吸附过程与液化过程相似，是放热过程，即温度升高；而解吸过程是吸热过程，温度要降低。例如在V