包涵体纯化和复性总结

板块一、大肠杆菌

（这里讨论的大肠杆菌为非分泌到培养基中的重组蛋白，是否有重组蛋白分泌到培养基中的工程菌我没有见过。）

一、关于菌体的量

大肠杆菌表达的基因工程蛋白是纯化人员最方便获得的原料，对纯化工艺开发来说几乎没有原料方面的限制。常看到有战友用个几毫升的菌液去做纯化，对此我十分不解，同样要做，为什么不多做点呢？很少的菌体会给纯化带来一些难以估计的问题，工艺的重复性和放大往往出现问题。因此，要做个好工艺就多发酵表达一些菌体吧。我做纯化时，初始工艺摸索用的菌体量一般为10g左右。

二、关于是否包涵体表达

包涵体的定义我就不讲了。我要讲的是，一个基因工程蛋白是否是包涵体表达的说法本身就不完全准确。至于包涵体在电镜下的晶体颗粒表现等等对我们纯化来说毫无意义，我相信做纯化工艺的人没有谁去看这个电镜，也不关心。我们判断的依据只是SDS-PAGE，目的蛋白在破菌沉淀中，我们就认为是包涵体表达，但这是一个似是而非的结论。看着没问题，实际上是有毛病的。关键在于你用的是什么破菌缓冲液！有些蛋白在用缓冲液A破菌时是在破菌沉淀中，而用缓冲液B破菌时却在破菌上清中。缓冲液A和B的差别可能只是pH上相差1-2个单位。那么它是包涵体表达还是可溶上清表达呢？ 说这

板块一、大肠杆菌

（这里讨论的大肠杆菌为非分泌到培养基中的重组蛋白，是否有重组蛋白分泌到培养基中的工程菌我没有见过。）

一、关于菌体的量

大肠杆菌表达的基因工程蛋白是纯化人员最方便获得的原料，对纯化工艺开发来说几乎没有原料方面的限制。常看到有战友用个几毫升的菌液去做纯化，对此我十分不解，同样要做，为什么不多做点呢？很少的菌体会给纯化带来一些难以估计的问题，工艺的重复性和放大往往出现问题。因此，要做个好工艺就多发酵表达一些菌体吧。我做纯化时，初始工艺摸索用的菌体量一般为10g左右。

二、关于是否包涵体表达

包涵体的定义我就不讲了。我要讲的是，一个基因工程蛋白是否是包涵体表达的说法本身就不完全准确。至于包涵体在电镜下的晶体颗粒表现等等对我们纯化来说毫无意义，我相信做纯化工艺的人没有谁去看这个电镜，也不关心。我们判断的依据只是SDS-PAGE，目的蛋白在破菌沉淀中，我们就认为是包涵体表达，但这是一个似是而非的结论。看着没问题，实际上是有毛病的。关键在于你用的是什么破菌缓冲液！有些蛋白在用缓冲液A破菌时是在破菌沉淀中，而用缓冲液B破菌时却在破菌上清中。缓冲液A和B的差别可能只是pH上相差1-2个单位。那么它是包涵体表达还是可溶上清表达呢？ 说这

1．菌体的收集和破碎

用50 ml离心管分别收集诱导表达后的培养物，8000 rpm 4℃离心10 min(离心时间和速度应该都不够)。沉淀用适量的超声破菌缓冲液重悬。

【备注】超声破菌缓冲液：20 mmol/L Tris-HCl pH8.0、0.5 mol/L NaCl、1 mmol/L EDTA、1 mg/mL溶菌酶（暂时我没用）

重悬后的菌液于冰浴中进行超声波破碎，其条件为：功率为300W，占空比50%，每个循环30 s，总时间20 min。破碎后的匀浆， 4℃、 12000 rpm离心15 min。分别取上清液和沉淀进行12% SDS-PAGE分析，确定目的蛋白是否以包涵体的形式表达。

2．包涵体的处理

洗涤：沉淀用适量的包涵体洗涤缓冲液重悬后，搅拌洗涤20~30 min，于4℃，12000 rpm离心15 min，弃去上清液。重复一次。再用适量的50 mmol/L Tris pH8.0溶液洗涤一遍（以去除残留的EDTA），于4℃ 12000 rpm离心15 min，弃去上清液。

【备注】包涵体洗涤缓冲液（20 mmol/L Tris－HCl pH 8.0，0.5 mol/L NaCl，2 mol/L尿素，2％ Triton）

2％T

His标签蛋白纯化步骤

若目的蛋白在上清表达，则使用试剂盒buffer（Novagen His?Bind Purification Kit, 70239）；若为包涵体，则需自配buffer。 （1）试剂准备 ① 12.5mL 1×charge buffer （1.6mL原液+10.9mLSW） ② 32.5mL 1×binding buffer （4mL原液+28.5mLSW） ③ 15mL 1×wash buffer （1.9mL原液+13.1mLSW） ④ 15mL 1×Elute buffer (3.8mL原液+11.2mLSW) （2）装柱

①盖上下盖，轻轻混匀His-bind Resin（若柱子不是首次使用，只需把已再生的柱床小心重悬，同样过夜沉降即可）。

②转移4mLHis-bind Resin至柱中，沿管壁流下，一次性加足，否则胶面会形成断面，影响吸附效果。

③用封口膜封住上口，置4℃冰箱，沉降过夜。 （3）过柱前准备（大约1h）

①使胶床上液依重力自动流下。

②待留至床顶时，依次加入以下溶液（用滴管沿管壁小心加入，且要一次性加足） a.7.5mL无菌SW b.12.5mL 1×charge buffer c.7.5mL 1×b

同样采用Ni-NTA His结合树脂亲和纯化重组目的蛋白，

1、200mL菌液离心收集大量诱导的菌体，并用1×PBS缓冲液洗涤两次。

2、将保存的菌体沉淀用总体积为20mL的1×Bind Buffer (300mM NaCl，50Mm NaH2PO4; 10mM imidazote,pH8.0)重悬，在冰浴中超声波破菌至溶液呈白色澄清。

3、4℃ 12,000 rpm离心30分钟，然后用20mL的包涵体洗涤Buffer (50mmol/L Tris-HCl，100mmol/L NaCl，1mmol/L EDTA，0.5% Triton x-100，pH8.0)洗涤沉淀两次。

4、加20mL的包涵体溶解Buffer（50mmol/L Tris-HCl，100mmol/L NaCl，8mol/L Urea，pH8.0）充分溶解，（旋涡溶解，最好溶解时间长一点，1h左右，也可以用冰盒装放摇床上1h ），4℃10,000 r/min离心30min，收集上清。 2.2.2 亲和层析纯化表达的蛋白

pQE40和pET-32a(+)载体表达的蛋白C﹑N端均融合了6个组氨酸的tag，可用金属螯和层析纯化，也可用抗6个组氨酸的单克隆抗体检测表达蛋白的正确性。

同样采用Ni-NTA His结合树脂亲和纯化重组目的蛋白，

1、200mL菌液离心收集大量诱导的菌体，并用1×PBS缓冲液洗涤两次。

2、将保存的菌体沉淀用总体积为20mL的1×Bind Buffer (300mM NaCl，50Mm NaH2PO4; 10mM imidazote,pH8.0)重悬，在冰浴中超声波破菌至溶液呈白色澄清。

3、4℃ 12,000 rpm离心30分钟，然后用20mL的包涵体洗涤Buffer (50mmol/L Tris-HCl，100mmol/L NaCl，1mmol/L EDTA，0.5% Triton x-100，pH8.0)洗涤沉淀两次。

4、加20mL的包涵体溶解Buffer（50mmol/L Tris-HCl，100mmol/L NaCl，8mol/L Urea，pH8.0）充分溶解，（旋涡溶解，最好溶解时间长一点，1h左右，也可以用冰盒装放摇床上1h ），4℃10,000 r/min离心30min，收集上清。 2.2.2 亲和层析纯化表达的蛋白

pQE40和pET-32a(+)载体表达的蛋白C﹑N端均融合了6个组氨酸的tag，可用金属螯和层析纯化，也可用抗6个组氨酸的单克隆抗体检测表达蛋白的正确性。

同样采用Ni-NTA His结合树脂亲和纯化重组目的蛋白，

1、200mL菌液离心收集大量诱导的菌体，并用1×PBS缓冲液洗涤两次。

2、将保存的菌体沉淀用总体积为20mL的1×Bind Buffer (300mM NaCl，50Mm NaH2PO4; 10mM imidazote,pH8.0)重悬，在冰浴中超声波破菌至溶液呈白色澄清。

3、4℃ 12,000 rpm离心30分钟，然后用20mL的包涵体洗涤Buffer (50mmol/L Tris-HCl，100mmol/L NaCl，1mmol/L EDTA，0.5% Triton x-100，pH8.0)洗涤沉淀两次。

4、加20mL的包涵体溶解Buffer（50mmol/L Tris-HCl，100mmol/L NaCl，8mol/L Urea，pH8.0）充分溶解，（旋涡溶解，最好溶解时间长一点，1h左右，也可以用冰盒装放摇床上1h ），4℃10,000 r/min离心30min，收集上清。 2.2.2 亲和层析纯化表达的蛋白

pQE40和pET-32a(+)载体表达的蛋白C﹑N端均融合了6个组氨酸的tag，可用金属螯和层析纯化，也可用抗6个组氨酸的单克隆抗体检测表达蛋白的正确性。

接种、分离纯化和培养技术

一、接种

将微生物接到适于它生长繁殖的人工培养基上或活的生物体内的过程叫做接种。 １、接种工具和方法

在实验室或工厂实践中，用得最多的接种工具是接种环、接种针。由于接种要求或方法的不同，接种针的针尖部常做成不同的形状，有刀形、耙形等之分。有时滴管、吸管也可作为接种工具进行液体接种。在固体培养基表面要将菌液均匀涂布时，需要用到涂布棒。（图３－３）

图３－３ 接种和分离工具

1．接种针 2.接种环 3.接种钩 4.5.玻璃涂棒 6.接种圈 7.接种锄 8.小解剖刀

常用的接种方法有以下几种：

１）划线接种 这是最常用的接种方法。即在固体培养基表面作来回直线形的移动，就可达到接种的作用。常用的接种工具有接种环，接种针等。在斜面接种和平板划线中就常用此法。 ２）三点接种 在研究霉菌形态时常用此法。此法即把少量的微生物接种在平板表面上，成等边三角形的三点，让它各自独立形成菌落后，来观察、研究它们的形态。除三点外，也有一点或多点进行接种的。

３）穿刺接种 在保藏厌氧菌种或研究微生物的动力时常采用此法。做穿刺接种时，用的接种工具是接种针。用的培养基一般是半固体培养基。它的做法是：用接种针蘸取少量的菌种，沿半固体培养基中心向管底作直线穿刺，如某

黄芩苷的提取和分离纯化

姓名：黄冰专业：药化学号：2111140006

黄芩中黄芩苷的提取和精制

一、实验目的

1掌握从黄芩中提取、精制黄芩苷的原理、方法及操作要点。2掌握黄芩苷的结构鉴定原理及方法。

二、实验原理

黄芩苷为一连有葡萄糖醛酸结构的黄酮化合物, 具有一定的脂溶性, 所以在提取时可以选择一定浓度的乙醇溶液作为提取液。

黄芩苷为葡萄糖醛酸苷, 具有弱酸性, 其可在碱性溶液中溶解, 形成钠盐,在提取液中加酸酸化，使黄芩苷游离析出。利用黄芩苷能溶于碱，不溶于酸的性质使之与酸性杂质分

离，进行精制。

本实验选用了60%乙醇回流提取，酸沉、碱溶、酸沉的方法进行精制，并对精制品进行了简单的定性鉴别，没有对照品，所以没做定量实验。

三、实验材料与仪器

材料：黄芩干燥根，硅胶G薄层层析板

仪器：UV2550紫外可见分光光度计（日本岛津），Spectrum 100傅立叶红外光谱仪，旋转蒸发仪（上海亚荣生化仪器厂），LXJ-Ⅱ离心沉淀机（上海医用分析仪器厂），200g摇摆式高速中药粉碎机，电子天平，循环水式真空泵，抽滤装置，圆底烧瓶（500ml），水浴锅，冷凝管，索氏提取器，层析缸

试剂：2mol/L盐酸，60%乙醇，10%氢氧化钠，乙酸乙酯，甲醇，甲酸

四、实验步骤

1 黄芩苷

环工综合实验细菌的分离纯化和接种实验

实验报告

环境科学与工程学院实验中心

实验题目 细菌的分离纯化和接种实验 实验类别 综合

实验原理问答题：

1. 为什么湖水用10_4、10_5

低的浓度? 答：因为在这三个浓度范围内能尽量使样品中的微生物分散开, /细胞存在，否则一个菌落就不只是代表一个个体生长而成的，从而方便计数。

2. 为什么平板培养皿要倒置放入恒温箱中进行培养

:第一，为了防止重力对菌落的生成产生影响；第二，为了防止培养基中的水 分蒸发后凝结在壁上，滴落后影响菌的生长和形态观察；第三，防止培养基干涸。

3. 微生物常用接种方式有哪些？进行微生物接种应该注意哪些方面?

答：⑴划线接种，涂布接种，穿刺接种，三点接种，浇混接种，液体接种，注射 接种，活体接种等。

⑵接种用具及培养基等均需灭菌处理， 接种过程必须在煤气灯旁进行，接种 环、玻

璃涂棒等器具要过火处理，把所要用到的器材和菌种培养基有序编号放置， 操作时应避免已经灭菌处理的材料用具与周围的物品的接触， 往培养基是划线或 点菌时动作要轻以防把培养基划破等。

四、实验步骤

1. 制备细菌稀释液：

使用5ml 移液管加4.5ml 无菌水放入贴有10-3、10-4、10-5、10-6

标签的小试管中， 用一根Iml