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HCV Genotype II

08L21-9051-608500/R1Rx Only

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首先我们得来说说染料法SYBR Green的原理，SYBR Green能够结合在双链DNA上面的荧光染料，只有结合了双链DNA，才会发荧光，而游离的不会发光。 图1 SYBR Green原理 但是，染料没有选择特异性，就是只要有双链DNA，就会染上，并发荧光。 如果使用的引物产生了非特异性扩增，那么荧光强度就不是目的条带真实的强度，因此会产生严重偏差。融解曲线 我们如何判断本次qPCR扩增的都是目的片段呢？这就需要用到融解曲线。 在qPCR循环反应结束之后，系统会进行测定融解曲线，通常的方式就是从70度加热到90度，然后每隔一定时间（1s或者少于1s）测定系统荧光强度，随着温度的升高，dsDNA都解开双链，SYBR Green都游离之后不发荧光，荧光逐渐下降。那么画出来一个个荧光强度和温度的曲线： 图2 融解曲线 然后我们运用医学中学到的高等数学C的求导，把荧光强度对温度求导，得出下图 图3 融解曲线的求导 为什么中间的峰那么高？ dR/dT 越大，表明荧光值变化最快。随着温度上升，达到图中Tm点时，大部分扩增出来的双链DNA解开，荧光值下降非常快。如果qPCR产物非常特异那么，融解曲线在80-90之间会形成一个单峰(温度和qPCR

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RNA的提取，cDNA合成及realtime PCR

RNA提取 cDNA合成

RT- PCR 或 realtime PCR 一：RNA提取

1．RNA提取中应该注意的事项

模板mRNA的质量直接影响到cDNA合成的效率。由于mRNA分子的结构特点,容易受RNA酶的攻击反应而降解,加上RNA酶极为稳定且广泛存在,因而在提取过程中要严格防止RNA酶的污染,并设法抑制其活性,这是本实验成败的关键。所有的组织中均存在RNA酶,人的皮肤、手指、试剂、容器等均可能被污染，因此全部实验过程中均需戴手套操作并经常更换（使用一次性手套）。所用的玻璃器皿需置于干燥烘箱中200℃烘烤2小时以上。凡是不能用高温烘烤的材料如塑料容器等皆可用0.1%的焦碳酸二乙酯(DEPC)水溶液处理,再用蒸馏水冲净。DEPC是RNA酶的化学修饰剂,它和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环反应而抑制酶活性。DEPC与氨水溶液混合会产生致癌物,因而使用时需小心。

细胞内总RNA制备方法很多,如异硫氰酸胍热苯酚法等，许多公司有现成的总RNA提取试剂盒,可快速有效地提取到高质量的总RNA。本实验室采用Trizol?试剂进行总RNA的提取，纯化的mRNA在70%乙醇中-80℃可保存一年以