运载体和基因表达载体的区别

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2运载体与基因表达载体的区别

1、不同点：

⑴“运载体”泛指基因工程操作中能将目的基因送达受体细胞的工具。如细菌质粒等。

相对“基因表达载体”而言，“运载体”主要是强调它能运输目的基因这一功能，只要能运输目的基因就算是运载体，并不计较是不是真正运输了目的基因。

⑵“基因表达载体”，是实施了运输目的基因、并且要保证目的基因到达受体细胞后能够表达的运载体。

这样看来，运载体、基因表达载体二者之间就不能完全等同。

2、联系：

“基因表达载体”是在”运载体”的基础上构建成的。

基因表达载体的构成：目的基因+ 启动子+ 终止子+ 标记基因。

3、表达载体上的启动子和终止子是本身具有还是后加上去的呢？

这个问题，教科书中并没有明确说明，但我个人的观点是：这要看获取目的基因的方法，而问题的根源在于基因的结构。关于基因的结构，在新课程标准中也不再做为教学的要求了。

（人类）结构基因的基本结构：上游非编码区+ 启动子+ 编码区+ 终止子+ 下游非编码区

人类结构基因4个区域：

①前导区，位于编码区上游，相当于RNA5’末端非编码区（非翻译区）；

②编码区，包括外显子与内含子；

③尾部区，位于RNA3’编码区下游，相当于末端非编码区（非翻译区）；

④调控区，包括

关于表达载体的构建

1. 表达载体（expression vector）：能使目的基因在宿主细胞中表达的一类载体。这类

载体既有复制子，更要有强启动子； 2. 大肠杆菌中的表达载体应含有 （1）强启动子

（2）在启动子下游区和ATG上游区有一个好的SD序列。

（3）在外源基因插入序列下游区要有一个强的转录终止序列，保证外源基因有效转录和质粒的稳定性。

我们实验室常用的就是PBI121的表达型载体，该载体具有35S强启动子，下游有MCS，并且具有T-DNA插入片段和Tet和Kan的抗性位点，有利于作为农杆菌浸染植物的表达载体。

3. 载体构建的步骤 （1）.设计引物

1.引物的长度 用于PCR扩增的寡核苷酸引物至少应在16个碱基以上，一般以20—30个碱基为宜，引物过短会使PCR特异性降低，过长则会引起引物间的退火而影响有效扩增。 2. 引物自身序列应位于高度保守区，与非扩增区无同源序列。 引物中碱基分布应尽可能避免嘌呤、嘧啶的连续排列，引物间3’端的互补、二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。

3. Tm值 引物的Tm值一般控制在55-60度, 尽可能保证上下游引物的Tm值一致,一般不超过2度. 如果引物中的G+C含量相对偏低,则

基因克隆的质粒载体

在大肠杆菌的各种菌体中找到了许多种不同类型的质粒，其中已经作了比较详尽研究的主要有F质粒、R质粒和Col质粒。

①F质粒 又叫F因子或性质粒（sex plasmid）。它们能够使寄主染色体上的基因和F质粒一道转移到原先不存在该质粒的受体细胞中去。

②R质粒 通称抗药性因子。它们编码有一种或数种抗菌素抗性基因，并且通常能够将此种抗性转移到缺管该质粒的适宜的受体细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力。

③Col质粒 即所谓产生大肠杆菌素因子。它们编码有控制大肠杆菌素合成的基因。大肠杆菌是一类可以使不带有Col质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死的蛋白质。

第一节 质粒的一般生物学特性

一、质粒DNA

细菌质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体的自主复制的遗传成份。绝大多数的质粒都是由环形双DNA组成的复制子（图4-1）。

1

质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外的游离状，但在一定的条件下又可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。

环形双链的质粒DNA分子具有三种不同的构型：

1．当其两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构时，称之为共价闭合环形DNA（cccDNA），

脂联素

H nij n ln cn eeo g aA ig ic il am eS4

a d VeeayMei ie n it r rcn dn

N 2 0 9 o1 2 0

脂牛素基因联真核表达体载构建的及鉴定黄海龙 王，哲 于健国孙，,佳 (吉.大学林畜牧兽医学院，1吉长林春10;.63022林吉农业大学动科学技物术院，学吉林长春10 1 3)18 图分中号类 8: 32￥文献标识码： 文章编A号：40 04—2 02— )0—43 10 73 0(9 1 000

关键词：;牛脂联素基因；真核表达载摘体：要了构建脂联牛素基真核表达载体因，为试验采用 RT— P方法扩增R牛脂联素 o(iae iC b vd— n pcnB vnD 基N因 o,e t oA, P i)将其克隆到p 1 M D一8T体载中，正序的质确粒经 Eo I和 N测 ctR Io双酶 ,切回收目基的片因将段定其向克隆到pIZ tC o A载体P中，建重质粒组p Z￣I oA P结果表。构 P C Bo vDN A明：克隆基因的序与 G n列 ka Be n布的公序有 10列 0%同源性的；目的基因向正插入，阅读框正确无误 ,说牛明脂联素基因真核表达载体构建功成。C

表达载体的构建方法及步骤

一、载体的选择及如何阅读质粒图谱

目前，载体主要有病毒和非病毒两大类,其中质粒 DNA 是一种新的非病毒转基因载体。

一个合格质粒的组成要素：

（1）复制起始位点 Ori 即控制复制起始的位点。原核生物 DNA 分子中只有一个复制起始点。而

真核生物 DNA 分子有多个复制起始位点。

（2）抗生素抗性基因可以便于加以检测，如 Amp+ ,Kan+

（3）多克隆位点 MCS 克隆携带外源基因片段

（4） P/E 启动子/增强子

（5）Terms 终止信号

（6）加 poly（A）信号可以起到稳定 mRNA 作用

选择载体主要依据构建的目的，同时要考虑载体中应有合适的限制酶切位点。如果构建的目

的是要表达一个特定的基因，则要选择合适的表达载体。

载体选择主要考虑下述3点：

【1】构建 DNA 重组体的目的，克隆扩增/基因表达，选择合适的克隆载体/表达载体。

【2】.载体的类型：

（1）克隆载体的克隆能力－据克隆片段大小（大选大，小选小）。

1 / 1文档可自由编辑

如<10kb 选质粒。

（2）表达载体据受体细胞类型－原核/真核/穿梭，E.coli/哺乳类细胞表达载体。

（3）对原核表达载体应该注意：选择合适的启动子及相应的受体菌，用于表达真核蛋白质时注意克服4个困难和阅读框错位

目的：克隆大鼠左旋氨基酸转运体(SLC7a8)基因cDNA的读码框(CDS),构建携带SLC7a8基因的重组真核表达载体,为进一步研究其在自发性高血压大鼠(spontaneously hypertensive rats,SHR)中的功能作准备。方法：从非高血压大鼠(wistar-kyoto,WKY)肾脏组织提取总RNA,通过RT-PCR得到总cDNA,PCR法扩增,产物连接pGEM-T Easy载体测序分析正确后,再以PCR方法扩增,将其连接入真核表达质

第 41卷第 6期 2 01 1年 1 1月

温

州

医

学

院

学

报

Vo1 . . No 6 41No 2 v. 011

J u na f W e z o e i a le e o r l o n h u M d c lCo l g

■大鼠 S C a基因的克隆及真核表达载体的构建 L T8王本极，黄晓燕，林素，周希，戴晓春，方俊旭，杨德业( . JJ 1温，医学院附属第一医院心内科，温州医学院心血管生物和基因研究所，浙江温Jl 3 5 0 i、 i 200、2温州医学院 .眼视光学院，浙江温州 3 5 0 ) 2 0 0

■

[摘

要]目的：克隆大鼠左旋氨基酸转运体 (L 78 SCa )基因eN

pGEX_vector_map-表达载体

GE Healthcare

pGEX vectors, GST Gene Fusion System

Map of the glutathione S-transferase fusion vectors showing reading frames and main features. Even though stop codons in all three frames are not depicted in this map, all thirteen vectors have stop codons in all three frames downstream from the multiple cloning site.

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pGEX-1λT EcoRI/BAP 5 µg 28-9546-56pGEX-2T 25 µg 28-9546-53pGEX-2TK 25 µg 28-9546-46pGEX-3X 25 µg 28-9546-54pGEX-4T-1 25 µg

基因工程载体

---乳酸菌表达载体pMG36e及其应用现状

目前，多数外源基因的克隆与表达，主要采用大肠杆菌。然而，由于大肠杆

菌能够引起人类和动物发生不同程度的腹泻，导致机体损伤，所以其表达产物需要经过复杂的分离纯化才能达到食品医药标准。与之相比，乳酸菌作为人和动物肠道内正常菌群之一，已被证明具有诸多益生功能，而且被公认为安全无毒的 (Generally regarded as safe，GRAS)。因此，采用乳酸菌表达的外源蛋白质可免去上述复杂、繁琐的后提纯工艺；同时，乳酸菌可以在肠道中存活定植，其外源基因表达用于治疗或免疫作用的活性物质可以持续地在肠道中产生，成为人和动物体内功能性生物制剂的“加工车间”，从而起到相应的保护和治疗性作用。

乳酸菌（Lacticacidbacteria，LAB）是一类能够发酵糖类产生乳酸的革兰氏阳性细菌［1］，具有诸如缓解乳糖不耐症、调节消化道微生态平衡等益生作用，应用领域十分广泛。随着近二十几年来分子生物学的发展，以乳酸菌作为宿主，利用质粒表达外源基因，对乳酸菌进行改造以进一步提高其功能已成为目前的研究热点之一。乳酸菌常用质粒载体主要有pWV01衍生载体，pNZ系列载体［2］等。质粒pMG36e来源

Invitrogen公司

pcDNA=CMV; pEF=EF-1a; pUb=Ub;-TOPO=TOPO克隆，/Gateway；-His/V5/myc tagged;抗性Neo/Zeo/Hyg/Bsd

载体名称 pcDNA5/FRT/V5-His-TOPO pEF5/FRT/V5-DST

pEF5/FRT/V5-D-TOPO pSecTag/FRT/V5-His-TOPO pcDNA5/FRT

分子增强内含

启动子 量 子 子 5.2 CMV 7.5 EF-1a

V5

5.8 5.2 CMV

/

/

/

V5,6*Igk信号，分泌表达

His 融合蛋白

RNA聚合酶

N端Tag C端Tag V5,6*

His

特殊序列

中止poly抗性检测表达方

复制起始 克隆 纯化

序列 A 筛选 方法 式

TOPO

Ni

稳定

Bsd Neo Bsd

备注

有

BGH pUC

Gatewa

抗V5y

抗体

Hyg

检测

TOPO

Ni

酶切 Neo

形成相同基因的细胞；必须和Fip重组表达载体pOG44共转染Fip细胞

pcDNA3.2/V5-G

W/D-TOPO pcDNA6.2/V5-G

W/D-TOPO pcDNA3.2

一、目的基因的a(4.2k) PCR

1、PCR体系（引物ath-a-4.2k-F ath-a-4.2k-R 酶 fusion聚合酶 体积单位 μ l） DNA fusion 5*fusionHF 2.5mM F R ddH2O Buffer dNTP 2 *3 0.25 0.75 4 12 2 6 0.5 1.5 0.5 1.5 10.75 32.75 totle 20 60 98°C 30s 98°C 15s 56°C 30s 72°C 4min30s 72°C10min 16°C∝ 30cycle

（注：聚合酶说明：fusion聚合酶是高保真聚合酶，扩增片段为平末端） 2、跑胶

1％琼脂糖凝胶胶跑20min，观察实验结果。 3、胶回收（试剂盒回收） （1）、在紫外光下将扩增条带用刀切下，要尽量快（紫外会诱导基因突变）放在1.5mL的离心管中；（注意：刀头尽量伸进离心管内部，防止污染离心管外部可接触部位） （2）、在离心管中加入300-400μ l的Buffer DE-A，混合均匀后于75°C水浴锅加热溶解直至透明； （3）、加0.5倍Buffer DE-A体积的Buffer DE-B，混合均匀。 （4）、吸取步骤3