药品微生物检验替代方法验证指导原则

1．主题内容与适用范围

1．1本规程规定了药品微生物检验替代方法验证的操作方法与要求。

1．2 本规程适用于药品用微生物检验替代方法验证的项目。

2. 引用标准

2．1《中华人民共和国药典》2010版第二部

3．简述

3．1本操作规程是为所采用的试验方法能否替代药典规定的方法用于药品微生物的检验

提供指导。

3．2随着微生物学的迅速发展，制药领域不断引入了一些新的微生物检验技术，大体可分

为三类：

3．2．1基于微生物生长信息的检验技术，如生物发光技术、电化学技术、比浊法等

3．2．2直接测定被测介质中活微生物的检验技术，如固相细胞技术法、流式细胞计数法等

3．2．3基于微生物细胞所含有特定组成成分的分析技术，如脂肪酸测定技术、核酸扩增技

术、基因指纹分析技术等。

3．2．4这些方法与传统检查方法比较，或简便快速，或具有实时或近实时监控的潜力，使

生产早期采取纠正措施及监控和指导优良生产成为可能，同时新技术的使用也促进了生产成本降低及检验水平的提高。

3．3在控制药品微生物质量中，微生物实验室出于各种原因如成本、生产量、快速简便及

提高药品质量等需要而采用非药典规定的检验方法（即替代方法）时，应进行替代方法的验证，确认其应用效果优于或等同于药典的方法。

4．微生物检验的类型及验

药品微生物限度检查及方法验证

从事药品微生物限度检查工作两年时间，从学做到承担工作到变得有点经验，经历了一个摸索、学习和积累的过程，回过头来做一个总结，把一些零散的经验和体会做一个梳理和归整，以供在此岗位工作的同仁参考。

第一部分：外围工作

外围工作主要有器皿清洗、灭菌，培养基、试剂配制及灭菌，无菌室清洁消毒等。 器皿的清洗是每个实验室和每一个实验员必须要做的最起码的工作，工作要求简单，操作方便，把握一个原则：干净。

培养基、试剂配制后一般都要求调PH到7.20，因为高温灭菌之后PH值会下降0.2左右。固体培养基在灭菌前要先加热煮沸，使琼脂均匀分散。煮沸时要注意不要溢出容器，以免发生烫伤。万一不小心溢出，可用一湿抹布盖住容器口，迅速将其从加热源上移开，不要在情急之下徒手去拿或者在容器侧面拿，那样容易被从容器口源源不断溢出的培养基烫伤。液体物品灭菌后，不能立即打开放气阀放气，因为此时被灭菌物品的温度大于100℃，在压力等于常压时，液体会暴沸，造成液体喷出或容器炸裂，发生事故。

万级洁净度的无菌室应当每周进行一次消毒，消毒剂每月更换一次，防止长期使用同一种消毒剂而使微生物形成耐药性。消毒范围包括墙壁，地面，天花板以及空气。表面消毒可以用消毒剂擦拭

微生物限度检查方法（平皿法）

验证方案

目 录

一、 验证方案的制定

二、 验证方案的起草与审批

三、微生物限度检查方法（平皿法）验证方案

1．验证目的和原理

2．验证方法步骤

3．试验实施

3.1试验前的准备

3.2验证试验操作

3.3试验结果

4．验证结果评价分析

第 1 页 共 14 页

5．附件

微生物限度检查方法（平皿法）验证文件

一、 验证方案的制定 验证项目名称 编号 验证小组组员 成员职务 组长 副组长 组员 姓名 步骤 验证方案组织实施进度 二、 验证方案的起草与审批 1验证方案的起草 验证项目名称 编号 微生物限度检查方法（平皿法）验证 VF-PR-17-A 第 2 页 共 14 页 主要工作职责 方案设计责任人 方案实施负责人 操作人 操作人 操作人 操作人 实施日期 微生物限度检查方法（平皿法）验证 VF-PR-17-A

微生物限度/无菌方法学验证流程

1.：提交单位购买申请菌种的购买：需要1.5个月

单位介绍信证明工作用途等文件，并向中检院网站提交申请，接到申请后一个月后中检院会把有

的菌种邮寄到使用单位，中检院菌种经常缺货并不是很齐全，不能一次买齐所需要的8种菌一次性买齐，

2. 每种从菌复活、分离、纯化复壮：共需要30天

药典规定进行药品检验所需8种标准阳性菌，购买中检院冻干菌粉后进行复活与保藏

1大肠埃希菌 2金黄色葡萄球菌 3枯草芽孢杆菌 4生孢梭菌 5铜绿假单胞菌 6沙门菌

（细菌每种冻干菌粉复活到分离纯化保藏各需要3-4天时间） 7白色念珠菌 8黑曲霉菌

（霉菌酵母菌冻干菌粉从复活到分离纯化制备孢子菌悬液需要至少7天时间）

3.培养基适用性/灵敏度验证：需要60-80天

实验中使用的培养基需要进行与中检院提供的标准培养基进行培养基适用性验证 每种培养基不同批号之间也需要进行验证之后方可以进行微生物检验用

药检室现有培养基种类20余种，每种培养基验证需要3-4天，完成所有培养基适用性验证需要60-80天。

恩替卡韦分散片微生物限度方法学适用性验证：

1. 回收率验证：回收率验证实验共需要26天

（若回收率达不

药品微生物学检验技术

第十二章 药品微生物检验方法验证的意及要求

第一节 药品微生物检验结果的影响因素

微生物的生长受很多因素的影响，特别是药品中污染的微生物尤为如此。药品微生物检验是检测药品中具有繁殖能力的活细胞，这些活的微生物在药品中处于不稳定的状态，它的检出与否受很多因素的影响，主要影响因素有如下几点： 一、供试品组分

由于供试品本身的特性，可能含有具有抑菌作用的组分成分，如抗生素中药中的黄莲、牛黄、冰片等。另外，很多供试品中加入的抑菌剂或防腐剂用于防止供试品中的微生物再污染和再生殖，以及增溶剂、乳化剂、抗氧剂等其他辅料，这些组分在一定浓度下对 微生物具有抑制作用，并可能对 药品中污染的微生物造成不同程度的损伤。供试品中污染的微生物在这些物质的影响下有可能检不出，这时，它们虽然被 抑制甚至受到损伤，但并未死亡，在一定条件在塔门还可以稳定地存活一段时间，当微生物生存环境改变时，如抑菌成分消除或浓度降低时，这些微生物便可以复苏并繁殖，患者使用后同样可危及人体健康。对于这些药品，如按常规方法进行微生物检验，往往显示假阴性结果。

除此之外，在药品微生物检验中，由于原料来源不同，特别是中药制剂，或者生产工艺的差别，使用的辅料不同等原因，使不

微生物限度/无菌方法学验证流程

1.：提交单位购买申请菌种的购买：需要1.5个月

单位介绍信证明工作用途等文件，并向中检院网站提交申请，接到申请后一个月后中检院会把有

的菌种邮寄到使用单位，中检院菌种经常缺货并不是很齐全，不能一次买齐所需要的8种菌一次性买齐，

2. 每种从菌复活、分离、纯化复壮：共需要30天

药典规定进行药品检验所需8种标准阳性菌，购买中检院冻干菌粉后进行复活与保藏

1大肠埃希菌 2金黄色葡萄球菌 3枯草芽孢杆菌 4生孢梭菌 5铜绿假单胞菌 6沙门菌

（细菌每种冻干菌粉复活到分离纯化保藏各需要3-4天时间） 7白色念珠菌 8黑曲霉菌

（霉菌酵母菌冻干菌粉从复活到分离纯化制备孢子菌悬液需要至少7天时间）

3.培养基适用性/灵敏度验证：需要60-80天

实验中使用的培养基需要进行与中检院提供的标准培养基进行培养基适用性验证 每种培养基不同批号之间也需要进行验证之后方可以进行微生物检验用

药检室现有培养基种类20余种，每种培养基验证需要3-4天，完成所有培养基适用性验证需要60-80天。

恩替卡韦分散片微生物限度方法学适用性验证：

1. 回收率验证：回收率验证实验共需要26天

（若回收率达不

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微生物实验室操作指导书目录

（一）安全守则 （二）检验总则 （三）基本技术要求 （四）食品平板菌落计数

（五）食品中大肠菌群、粪大肠菌群和大肠杆菌检验方法 （六）沙门氏菌检验 （七）金黄色葡萄球菌检验 （八）霉菌计数 （九）革兰氏染色

（十）空气中微生物的检验 （十一） 水中微生物的检验 （十二）食品接触面的微生物检验 （十三）蔬菜农残的快速检测

审核：

编制：

化验室操作指导书（受控） 1 （一）安全守则

1 进入实验室工作衣、帽、鞋必须穿戴整齐。

2 在进行高压、干燥、消毒等工作时，工作人员不得擅自离开现场，认真观察温度、时间，蒸馏易挥发、易燃液体时，不准直接加热，应置水浴锅上进行。

3 严禁用口直接吸取药品和菌液，按无菌操作进行，如发生菌液、病原体溅出容器外时，应立即用有效消毒剂进行彻底消毒，安全处理后方能离开现场。

4 工作完毕，两手用清水肥皂洗净，必要时可用（杀菌剂）新洁尔灭、过氧乙酸液浸泡手，然后用水冲洗，工作服应经常清洗，保持整洁，必要时高压消毒。

5 实验完毕，及时清理现场和实验用具，对染菌带毒物品，进行消毒灭菌处理，并填写日常工作记录。

6 每日下班，认真检查水、相关电

微生物 知识 管理

微生物实验室规范指导原则

微生物 知识 管理

影响药品微生物的检验结果的因素。 1、实验人员在取样或试验过程中污染微 生微。 2 、生物学分析方法本身的误差。 3 、样品中或环境中微生物分布不均匀等 因素在药品检验中，为保证微生物试验数 据的可靠性和重现性，药品微生物实验室 必须使用经验证的检测方法并按良好的实 验室规范指导试验。

微生物 知识 管理

药品微生物实验室规范包括以下几个方 面：人员、培养基、菌种、实验室的布 局和运行、设备、文件、实验记录、结 果的判断等。

微生物 知识 管理

人员培训从事药品微生物试验工作的人员均要受到教育、培训及 具备相关工作的经验。 微生物实验人员应具备微生物学或相近专业知识的教育 背景。 岗前培训 1 、根据实验人员的岗位及职责对其进行相应的培训 2、工作所必需的设备操作的培训 3、微生物检验技术的培训 4、实验室生物安全等方面的培训 经考核合格后方可上岗，同时，实验室应制定所有级 别实验人员的继续教育计划。

微生物 知识 管理

微生物实验室管理人员的培训 1、微生物实验室管理人员培训 包括：管理技能、实验室安全、试验按排、 预 算、实验室研究、实验结果评估和数据 偏差的调查及技术报告书写等。 。

微生物

空气、物表、器械、医务人员手微生物检测参考标准

一、空气微生物污染检验方法

采用平板暴露法操作

结果计算：按平均每皿的菌落数报告：CFU/(皿·暴露时间)。 结果判断：

Ⅱ环境： 手术室、供应室、计生手术室、产房、眼科治疗室 、婴儿室、

≤4.0cfu/皿（15min）

Ⅲ环境 各科治疗室、处置室、ICU、胃肠镜室、儿科病房、妇科检查室、急救室、

化验室血库、口腔科。 ≤4.0cfu/皿（5min）

二、物体表面微生物污染检查方法

检测方法：

把采样管充分震荡后，取不同稀释倍数的洗脱液1.0ml，接种平皿，将冷至40℃~45℃的熔化营养琼脂培养基每皿倾注15~20ml,36℃±1℃恒温培养箱48h，计数菌落数，必要时分离致病性微生物。（采样面积都为100cm2）

结果计算：

物体表面菌落总数（CFU/cm2）=

结果判断：

Ⅱ环境： 手术室、供应室、计生手术室、产房、眼科治疗室 、婴儿室。

≤5.0cfu/cm2

平均每皿菌落数×采样液稀释倍数

采样面积（cm2)

Ⅲ环境 各科治疗室、处置室、ICU、胃肠镜室、儿科病房、妇科检查室、急救室、

化验室血库 、口腔科。

论 著2013年7月

儿科护士由于担心固定不牢导致针头脱出，因而会下意识将绷带缠的较紧，在连续两到三天经留置针静脉输液后，在留置针尾端肝素帽和针体侧翼紧挨皮肤的位置，由于长时间低压力的原因，加上穿刺肢体由于留置有针头活动减少或不动，静脉回流轻微受阻，会在尾端压在皮肤位置形成皮肤压痕，如果局部有轻微的外渗，容易形成压疮，使用裁剪后绷带固定时由于在皮肤和留置针之间有一层带弹性透气的自粘绷带缓冲保护皮肤，上下两条根据不同直径固定压力有区别，没有固定过度，减少皮肤损伤，有效地减少减少皮肤形成压痕的机会，因此观察组皮肤压痕只有2例，对照组有18例，观察有明显差异。

3.3 提高护士工作效率

美国输液学会将静脉留置针留置时间规定为不超过96小时 ,中国中华护理学会输液治疗护理实践指南中指出儿童外周静脉留置针在没有并发症的去情况下可一直保留到治疗结束[5]。留置针固定的尾端使用裁剪后的自粘绷带后,尾端反折的现象不再出现，延长了留置时间,减少了重新穿刺的次数,而且由于自粘绷带的保护,无菌敷贴更换的次数减少,减轻了护士的工作量，有效提高儿科门急诊护士工作效率。

3.4 减少家长居家照顾的担心

门急诊使用留置针，治疗结束后要在家里护理留置针，影响家长门诊使用留置针的主