考马斯亮蓝结合法测定蛋白质浓度实验报告

实验八 考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量

一 实验目的

学会用考马斯亮蓝G-250法测定蛋白质含量

二 实验原理

考马斯亮蓝能与蛋白质的疏水微区结合，这种结合具有高度的敏感性。考马斯亮蓝G-250的磷酸溶液呈棕红色，最大吸收峰在465nm当它与蛋白质结合形成复合物时呈蓝色其最大吸收峰改为595nm，考马斯亮蓝G-250-复合物的高消光效应导致了蛋白质定量测定的高敏感度。

在一定范围内，考马斯亮蓝G-250-复合物呈色后，在595nm下吸光度与蛋白质含量呈线性关系，故可以用于蛋白质浓度的测定。

三 实验器材

（1）旋涡混合器。

（2）试管1.5cm×15cm（×8）

（3）吸管0.10ml（×1），0.50ml（×2），1.0ml（×2），2.0ml（×1），2.0ml（×1）。 （4）722型（或7220型）分光光度计。 （5）容量瓶1000ml（×1）。 （6）量筒100ml（×1）。 （7）电子分析天平。

四 实验试剂

1、9％NaCL溶液。

2、标准蛋白液；牛血清白蛋白（0.1mg/ml），准备称取牛血清白蛋白0.2g，用0.9%NaCl溶液溶解并稀释至2000ml。

3、染液：考马斯亮蓝G250(0.01%),称取0.1g考马

考马斯亮蓝法测定(实验报告)

考马斯亮蓝法测定苹果组织微量可溶性蛋白含量

吴凡郭梦雨

摘要: 本实验以苹果果肉为研究对象，采取考马斯亮蓝比色法测定蛋白质的吸光度值，通过对果实可溶性蛋白提取缓冲液、缓冲液浓度、pH fi、外源添加物对果

肉可溶性蛋白提取效率的影响的研究，优化苹果果实可溶性蛋白含量测定方法，以期优化果实可溶性蛋白测定条件，为客观反映果实可溶性蛋白水平提供一种可行的方法。结果表明：外源添加PV嗣EDT/以是苹果可溶性蛋白提取率的主要影响因素。实验最终确定的提取条件为0.1mol/L pH9.0 Tris-HCl 提取缓冲液(内含1mmol/L EDTA和1% PVP)，此条件下苹果果实可溶性蛋白的有效测定含量为34.93%。

关键词：苹果、考马斯亮蓝法、Tris-HCl 缓冲液、外援添加物

1 实验部分

1.1 实验原理

果蔬可溶性蛋白质含量(soluble protein content) 是一个重要的生理生化指标，也是果蔬品质和营养的重要评价指标之一。许多可溶性蛋白是构成果蔬中酶的重要组成部分，参与果蔬多种生理生化代谢过程的调控，与果蔬的生长发育、成熟衰老，抗病性、抗逆性密切相关。

考马斯亮蓝G-250在酸性游离状态下呈棕红色，最大光吸收在46

实验六 考马斯亮蓝染色法测定牛奶中蛋白质含量

一、目的要求

学习考马斯亮蓝染色法测定牛奶中蛋白质含量的方法和原理，标准曲线的绘制和回归方程的使用，分光光度计的使用。 二、基本原理

考马斯亮蓝所含疏水基团在酸性条件下与蛋白质的疏水微区具有亲和力。通过疏水作用与蛋白质相结合，形成的蓝色蛋白质染料复合物，在595 am处有最大吸光度，在一定的蛋白质浓度范围内，蛋白质染料复合物在595 nm处的吸光度与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质含量的测定。 分光光度法的原理：通过测定被测物质在特定波长处或一定波长范围内光的吸收度，对该物质进行定性和定量分析。 三、器材和试剂 1．器材

可见分光光度计，玻璃比色皿，试管 2．试剂

考马斯亮蓝G一250溶液：精确称取考马斯亮蓝G一250 100 mg，溶于50 mL 95％的乙醇，再加入100 mL 85％的磷酸，稀释定容至1 000 mL备用。

标准蛋白质溶液：精确称取牛血清白蛋白10 mg，加水溶解并定容至10 ml，冰冻，用时吸取上述溶液1 ml，用蒸馏水稀释至10 ml，即为100 μg/ml的标准蛋白质溶液。

样品的制作：准确吸取2 ml牛奶(市场上现买)加水至1000 ml制作样品。

四、操

蛋白测定经典法

蛋白质含量测定法——考马斯亮蓝法

[实验目的]

学习、掌握考马斯亮蓝法（Bradford法）测定蛋白质含量的方法

[实验原理]

考马斯亮蓝G 250染料

碱性

氨基酸 磷酸 max变为595nm（蓝色）

芳香族

[器材与试剂]

器材

722型可见光分光光度计、漩涡混合器、试管16支 试剂

1.标准蛋白质溶液，用牛血清清蛋白（BSA），配制成1.00mg/ml。

2.考马斯亮蓝G-250染料试剂：称100mg考马斯亮蓝，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85% 的磷酸，用水稀释至1升。

[实验方法]

标准方法

1.取10支试管，分别编号后按 表1 剂量依次加入标准蛋白（或未知蛋白）、去离子水和考马斯亮蓝染料。每支试管加完后，立即在漩涡混合器上混合。

2.加完染料20min后，使用722分光光度计，塑料比色皿，在595nm处测量吸光度A595。

3.用标准蛋白浓度（mg/ml）为横坐标，用A595为纵坐标，进行直线拟合，得到标准曲线。根据测得的未知样品的A595，代入公式即可求得未知样品的蛋白质含量。根据所测样品的吸光度,在标准曲线上查得相应的蛋白质含量,按下式计算: 样品蛋白质含量(μg/g鲜重) =

查得的蛋白质（ g/g） 提取液总体积（m

分光光度法介绍

分光光度法是利用溶液中特定溶质的光吸收测定其浓度的方法，其基本原理是根据Lambert和Beer定律。 一 Lambert定律

当一束平行单色光垂直照射于一均匀物质溶液时，溶液将吸收一部分光能，使光的强度减弱。若溶液的浓度不变，则在溶液中的光程越长，光线强度的减弱也越显著。 设：入射光强度为I0，透射光强度为I，L代表光在溶液中的光程。 I0

lg =K1L I

K1是常数，受光线波长，溶液性质，溶液浓度影响。 二 Beer定律

当一束光通过一溶液时，光能被溶液介质吸收一部分，若光程不变，则溶液的浓度越大，光吸收越强，透射光强度的减弱也越显著，光线减弱的比例与溶液浓度呈正比。 I0

lg =K2C I

K2为吸收系数，是常数。溶液对光吸收的强弱与溶液浓度C成正比。 三 Lambert-Beer定律 将以上两个定律合并： Io

lg =KCL I

IoI

令A=lg T= 则A=KCL=-lgT

IIoT为透光度，A为吸光度，K为消光系数

四 待测样品浓度的计算 A标=KC标L A样=KC样L 由于是同一物质及相同的光程，则：

A样/A标=KC样L/KC标L=C样/C标 即：C样=（A样/A标）*

双缩脲法测定蛋白质浓度——标准曲线的绘制 管号 试剂 2mg/ml卵清蛋白液/ml 蒸馏水/ml 双缩脲试剂/ml 蛋白质浓度/(mg/ml) A 0 0.0 3.0 2.0 0.0 0.000 1 0.3 2.7 2.0 0.2 0.245 2 0.6 2.4 2.0 0.4 0.345 3 0.9 2.1 2.0 0.6 0.398 4 1.2 1.8 2.0 0.8 0.488 5 1.5 1.5 2.0 1.0 0.574

充分混匀，在540nm比色

考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度——标准曲线的绘制 管号 试剂 标准蛋白液/ml 0.9% Nacl/ml 考马斯亮蓝染液/ml 蛋白质浓度/(微克/ml) A 0 0.0 1.0 4.0 0 0.000 1 0.1 0.9 4.0 10 0.009 2 0.2 0.8 4.0 20 0.041 3 0.3 0.7 4.0 30 0.077 4 0.4 0.6 4.0 40 0.083 5 0.6 0.4 4.0 50 0.123

充分混匀，在595nm比色

绘制 样液2样液2加3ml

卵清蛋白卵清蛋白加3ml

(A540nm)0.700

双缩尿法测定蛋白质浓度--标准曲线

A 线性

2.0 ? 0.927

2.

考马斯亮蓝

科技名词定义

中文名称：

考马斯亮蓝

英文名称：

Coomassie brilliant blue;coomassie [brilliant] blue

定义1：

属于三苯甲烷类染料，可与蛋白质形成较强的非共价复合体。考马斯亮蓝R250多用于聚丙烯酰胺凝胶电泳后蛋白质条带的染色；考马斯亮蓝G250是布拉德福德(Bradford)蛋白质定量试剂的主要成分。

所属学科：

生物化学与分子生物学（一级学科）；方法与技术（二级学科）

定义2：

广泛用于对电泳蛋白质染色的蓝色染料。也可显示出细胞骨架及蛋白质在细胞中的显微分布。

所属学科：

细胞生物学（一级学科）；细胞生物学技术（二级学科）

本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布 目录

化学性质 考马斯蓝染色 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量 处理方法 化学性质 考马斯蓝染色 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量 处理方法 展开 编辑本段化学性质 分子结构如右图 Coomassie brilliant blue G-250

考马斯亮蓝有G250和R250两种。

考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在465nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-

考马斯亮蓝

科技名词定义

中文名称：

考马斯亮蓝

英文名称：

Coomassie brilliant blue;coomassie [brilliant] blue

定义1：

属于三苯甲烷类染料，可与蛋白质形成较强的非共价复合体。考马斯亮蓝R250多用于聚丙烯酰胺凝胶电泳后蛋白质条带的染色；考马斯亮蓝G250是布拉德福德(Bradford)蛋白质定量试剂的主要成分。

所属学科：

生物化学与分子生物学（一级学科）；方法与技术（二级学科）

定义2：

广泛用于对电泳蛋白质染色的蓝色染料。也可显示出细胞骨架及蛋白质在细胞中的显微分布。

所属学科：

细胞生物学（一级学科）；细胞生物学技术（二级学科）

本内容由全国科学技术名词审定委员会审定公布 目录

化学性质 考马斯蓝染色 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量 处理方法 化学性质 考马斯蓝染色 考马斯亮蓝法测定蛋白质含量 处理方法 展开 编辑本段化学性质 分子结构如右图 Coomassie brilliant blue G-250

考马斯亮蓝有G250和R250两种。

考马斯亮蓝G-250在游离状态下呈红色，最大光吸收在465nm；当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-

凝胶层析法测定蛋白质分子质量

一、 实验目的

1、了解凝胶层析的原理及其应用。

2、通过测定蛋白质分子质量的训练，初步掌握凝胶层析技术。 二、 实验原理

凝胶是一种具有立体网状结构且呈多孔的不溶性珠状的颗粒物质。用凝胶来分离物质，主要是根据多孔凝胶对不同半径的蛋白质分子（近似于球形）具有不同的排阻效应实现的。即它是根据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的筛孔，而后又被流出的洗脱液带走。分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出柱外，而大分子先从柱中流出。一些中等大小的分子介于大分子和小分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，即被部分排阻，因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。这样样品经过凝胶层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。

对于任何一种被分离的化合物在凝胶层析柱中被排阻的范围均在0~100%之间，其被排阻的程度可以用有效分配系数Kav（分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示，Kav值的大小和凝胶柱床的总体积（Vt）、外水体积（V0）以

半微量凯氏定氮法测定蛋白质含量

(一)方法原理

样品与硫酸一同加热消化, 分解有机质, 释放出的NH3 与硫酸结合成硫酸铵留在溶液中。在定氮消化瓶中,用氢氧化钠中和硫酸铵生成氢氧化铵,加热又分解NH3 ,用硼酸吸收, 用标定过的盐酸或硫酸滴定, 从而计算出总氮量, 换算为蛋白质量。

(二) 仪器、设备

1. 仪器

分析天平: 感量0.0001克；实验用粉碎机；半微量凯氏蒸馏装置；半微量滴定管, 容积10毫升；硬质凯氏烧瓶: 容积25毫升, 50毫升；锥形瓶: 容积150毫升；电炉: 600瓦。

2. 试剂

(1) 盐酸: 分析纯, 0.02mol/L, 0.05mol/L标准溶液(邻苯二甲酸氢钾法标定)；

(2) 氢氧化钠: 工业用或化学纯, 40%溶液(W/V)；

(3) 硼酸: 分析纯, 2%溶液(W/V)；

(4) 硼酸混合指示剂: 溴甲酚绿0.1克, 甲基红0.1克分别溶于95%乙醇中,混合后稀至100毫升, 将混合指示剂与2%硼酸溶液按 1:100比例混合, 用稀酸或稀碱调节PH值为

4.5, 使呈灰紫色, 此溶液放置时间不宜过长, 需在1个月之内使用；

(5) 加速剂: 五水合硫酸铜(分析纯)10克, 硫酸钾(分析纯)100克在研钵中研磨, 仔细混匀,