点突变southern杂交

分 子 植 物 病 理 学 实 验

--Southern杂交

（同位素标记，防止污染！注意物品的放置与处置，检测！）

核酸分子杂交技术是分子生物学领域中最常用的基本技术方法之一。其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下（适宜的温度及离子强度等）可按碱基互补原则退火形成双链，杂交的双方是待测核酸序列及探针。膜上印迹杂交是指待测核酸序列片段结合到一定的固相支持物，然后与存在于液相中标记的核酸探针进行杂交的过程，是目前最常用的一种核酸分子杂交方法。其操作基本流程是：首先用凝胶电泳方法将待测核酸片段分离，然后用印迹技术将分离的核酸片段转移到特异的固相支持物上，转移后的核酸片段将保持其原来的相对位置不变。再用标记的核酸探针与固相支持物上的核酸片段进行杂交。最后洗去未杂交的游离的探针分子，通过放射自显影等检测方法显示标记的探针的位置。由于探针已与待测核酸片段中的同源序列形成杂交分子，探针分子显示的位置及其量的多少，则反映待测核酸分子中是否存在相应的基因顺序及其量与大小。Southern印迹是指将电泳分离的DNA片段转移到一定的固相支持物上的过程。（目的：分析遗传位点、拷贝数；多态性；来源；文库分析；基因敲除；亚克隆；基因分离与检测等 ）

Southern杂交

Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量 基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。由于核酸分子的高度特异性及检测方法的灵敏性，综合凝胶电泳和核酸内切限制酶分析的结果，便可绘制出DNA分子的限制图谱。

Southern印迹杂交技术包括两个主要过程：一是将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，即印迹（blotting）；二是固定于膜上的核酸同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。该技术是1975年英国爱丁堡大学的E.M.Southern首创的，Southern印迹杂交故因此而得名。

Northern 印记杂交 Northern blot 是一种通过检测RNA的表达水平来检测基因表达的方法，通过northern blot的方法可以检

Southern Blotting技术总结

Southern Blotting溶液的配制： ※、变性缓冲液

1.5M NaCl 0.5M NaOH ※、中和缓冲液

1.5M NaCl 1.0 MTris?HCl Tris,HCl调pH8.0 ※、20×SSC 1L

3.0 M NaCl 0.3 M 柠檬酸钠 pH7.0) ※、2×SSC:

0.3 M NaCl, 0.03 M 柠檬酸钠(pH7.0) ※、洗膜液Ⅰ的配制： 2×SSC，0.1%SDS ※、洗膜液Ⅱ的配制： 0.5×SSC，0.1%SDS ※、Washing Buffer:

0.1 M Maleic Acid，0.15 M NaCl（pH7.5）,0.3%(V/V) Tween ※、Maleic Acid Buffer：0.1M Maleic Acid，0.15 M NaCl（pH7.5） ※、1×Blocking Solution：10×Blocking Solution(vial6),用Maleic Acid Buffer稀释10倍（现配现用）；

※、Antibody solution:每次使用前，4℃,10000rpm

第五章 基因突变及其他变异

本章提要：

概 时 原 特 意

念 间 因 点 义

可基因突变

人类型：概念、种类 遗 来类 传基因重组遗检测和预防

变 源传 异病人类基因组计划 个别染色体增减：

类型结 数染色体组：概念、判断

构 目染色体组二倍体、多倍体和单倍体： 概念、判断

变 变成倍增减多倍体：特点、诱导原理、育种方法

实质异 异单倍体：特点、育种方法

本章知识点：

第一节 基因突变和基因重组

一、 生物变异的类型

1、 不可遗传的变异（仅由环境变化引起）

2、可遗传的变异（由遗传物质的变化引起）：基因突变、基因重组、染色体变异

二、可遗传的变异

（一）基因突变

1、概念：是指DNA分子中碱基对的增添、缺失或改变，而引起的基因结构的改变。

2、原因：

（1）外因（诱发基因突变并提高变异频率）

①物理因素：X射线、激光等；

②化学因素：亚硝酸盐，碱基类似物等；

③生物因素：病毒、细菌等。

（2）内因（自然突变）：DNA复制时发生错误，基因结构改变。

3、特点：

（1）普遍性：任何生物都能发生（包括病毒、原核生物、真核生物）

（2）随机性：

①基因突变可以发生在生物个

第五章 基因突变及其他变异

本章提要：

概 时 原 特 意

念 间 因 点 义

可基因突变

人类型：概念、种类 遗 来类 传基因重组遗检测和预防

变 源传 异病人类基因组计划 个别染色体增减：

类型结 数染色体组：概念、判断

构 目染色体组二倍体、多倍体和单倍体： 概念、判断

变 变成倍增减多倍体：特点、诱导原理、育种方法

实质异 异单倍体：特点、育种方法

本章知识点：

第一节 基因突变和基因重组

一、 生物变异的类型

1、 不可遗传的变异（仅由环境变化引起）

2、可遗传的变异（由遗传物质的变化引起）：基因突变、基因重组、染色体变异

二、可遗传的变异

（一）基因突变

1、概念：是指DNA分子中碱基对的增添、缺失或改变，而引起的基因结构的改变。

2、原因：

（1）外因（诱发基因突变并提高变异频率）

①物理因素：X射线、激光等；

②化学因素：亚硝酸盐，碱基类似物等；

③生物因素：病毒、细菌等。

（2）内因（自然突变）：DNA复制时发生错误，基因结构改变。

3、特点：

（1）普遍性：任何生物都能发生（包括病毒、原核生物、真核生物）

（2）随机性：

①基因突变可以发生在生物个

基因定点突变

一、定点突变的目的

把目的基因上面的一个碱基换成另外一个碱基。 二、定点突变的原理

定点突变是指通过聚合酶链式反应（PCR）等方法向目的DNA片段（可以是基因组，也可以是质粒）中引入所需变化（通常是表征有利方向的变化），包括碱基的添加、删除、点突变等。定点突变能迅速、高效的提高DNA所表达的目的蛋白的性状及表征，是基因研究工作中一种非常有用的手段。

体外定点突变技术是研究蛋白质结构和功能之间的复杂关系的有力工具，也是实验室中改造/优化基因常用的手段。蛋白质的结构决定其功能，二者之间的关系是蛋白质组研究的重点之一。对某个已知基因的特定碱基进行定点改变、缺失或者插入，可以改变对应的氨基酸序列和蛋白质结构，对突变基因的表达产物进行研究有助于人类了解蛋白质结构和功能的关系，探讨蛋白质的结构/结构域。而利用定点突变技术改造基因：比如野生型的绿色荧光蛋白（wtGFP）是在紫外光激发下能够发出微弱的绿色荧光，经过对其发光结构域的特定氨基酸定点改造，现在的GFP能在可见光的波长范围被激发（吸收区红移），而且发光强度比原来强上百倍，甚至还出现了黄色荧光蛋白，蓝色荧光蛋白等等。定点突变技术的潜在应用领域很广，比如研究蛋白质相互作用位点的结构、改

酵母双杂交（筛库）

pGBK-gene 转化酵母

1. 酵母细胞（AH109）划线，YPDA平板，30°C烘箱培养18-20小时。

2. 挑取单细胞菌落，在YPDA培养基中，30°C摇床培养18-20小时至菌液饱和。

3. 次日，取饱和的酵母培养液5ml转接至100mlYPDA培养基中，30°C摇床培养2h，测

定OD600，直至OD600达到0.5左右。 4. （超净台下工作，下同）将上述菌液分装在2只50ml离心管（灭菌）中，室温下3000rpm

离心5min。

5. 弃上清，重悬于20ml无菌水中，3000rpm离心5min。

6. 弃上清，重悬于10ml 1×TE/LiAc溶液中，3000rpm离心5min。 7. 弃上清，重悬于500μl 1×TE/LiAc溶液中，室温温育10min。

8. 取eppendorf管，每管加100μl酵母细胞、5μl鲑鱼精DNA（10mg/ml，用之前沸水煮

2-3min，立即放冰上）、15μl DNA（pGBK连接的基因）。 9. 加入280μl PEG/LiAc 溶液，30°C放置45min（可摇）。 10. 42°C热激10min，立即放冰上2min。

11. 室温下6000-8000rpm离心20

山东大学实验报告 2013年 05 月 08 日

姓 名 班 级 同组人 科 目 遗传学实验 题 目 双因子杂交、伴性遗传和三点测交 组 别 第五组

一、研究背景

果蝇（Drossphila）是遗传学试验中最常用的多年生物之一。属昆虫纲，双翅目，果蝇科，果蝇属。果蝇的染色体数目少（仅四对，2n=8），具有许多自然的或诱发的可遗传突变性状，世代周期短（25℃下10~12天一代，个体小易于饲养，培养费用低廉，繁殖能力强，后代数目繁多，故被作为遗传学实验的典型模式生物。后续实验要作果蝇的杂交实验，需要大量的果蝇，本次实验可以学会识别果蝇的各种形状、区分果蝇的性别以及基本的饲养方法，为后续的实验打下基础。

黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)，果蝇科(Drosophilidae)果蝇属(Drosophila)昆虫。因其生活史短（在25℃左右温度下十天左右繁殖一代），繁殖力

山东大学实验报告 2013年 05 月 08 日

姓 名 班 级 同组人 科 目 遗传学实验 题 目 双因子杂交、伴性遗传和三点测交 组 别 第五组

一、研究背景

果蝇（Drossphila）是遗传学试验中最常用的多年生物之一。属昆虫纲，双翅目，果蝇科，果蝇属。果蝇的染色体数目少（仅四对，2n=8），具有许多自然的或诱发的可遗传突变性状，世代周期短（25℃下10~12天一代，个体小易于饲养，培养费用低廉，繁殖能力强，后代数目繁多，故被作为遗传学实验的典型模式生物。后续实验要作果蝇的杂交实验，需要大量的果蝇，本次实验可以学会识别果蝇的各种形状、区分果蝇的性别以及基本的饲养方法，为后续的实验打下基础。

黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)，果蝇科(Drosophilidae)果蝇属(Drosophila)昆虫。因其生活史短（在25℃左右温度下十天左右繁殖一代），繁殖力

区分等位基因内突变和非等位基因间突变 实验

一、【目的】

1、熟练掌握果蝇的杂交技术。

2、能通过实验区分等位基因间和非等位基因间的突变。 二、【原理】

基因突变：一个基因座的内部结构发生改变，导致基因的一种等位形式变成另一等位形式，也叫做点突变。

野生型等位基因：将自然界中普遍出现或指定实验用的某一品系的性状作为“野生型”或“正常”的性状，与这种性状相关的等位基因称为野生型等位基因。 突变型等位基因：任何不同于野生型等位基因的相同座位的基因称为突变型等位基因。

正向突变：从野生型等位基因变为突变型等位基因。 恢复突变：从突变型等位基因变为野生型等位基因。

突变体的表型特征：

（1）形态突变：突变导致生物体外观上可见的形态结构的改变。例如果蝇的红眼→白眼突变：

（2）生化突变：突变影响生物的代谢过程，导致一个特定生化功能的改变或丧失。如微生物的营养缺陷型

（3）致死突变：严重影响生物体生活力，导致个体死亡的突变。可分为显性致死突变（杂合态即可致死）和隐性致死突变（纯合态才致死）

（4）条件致死突变；引起生物体在某些条件下致死的突变。如噬菌