southern印迹杂交

蛋白免疫印迹杂交（Western Blot）技术手册

蛋白免疫印迹杂交（Western Blot. WB）是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离，再转移到杂交膜（blot）上，然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。WB是进行蛋白质分析最流行和成熟的技术之一。

本指南讨论Western Blot操作方法及常见问题分析，有助于成功完成WB。 A 蛋白样本提取制备

1 细胞或组织裂解

2 蛋白酶和磷酸酶抑制剂 3 蛋白定量

4 电泳上样样品的准备 B 电泳

1 PAGE胶的制备 2 蛋白分子量Marker 3 阳性对照 4 内参对照 5 上样与电泳

C 转膜与显色（Western Blot）

1 胶中蛋白的检测 2 蛋白转膜

3 膜上蛋白的检测：丽春红 4 膜的封闭 5 一抗的孵育 6 二抗的孵育 7 显色

D 常见问题分析与解决方案

附录1 WB实验试剂配制方法 附录2 SDS-PAGE胶的配制

1

WB概述:检测原理

Western Blot过程示意图

聚丙烯酰胺凝胶电泳

转膜

封闭

孵育1小时或过夜 孵育一抗 孵育1小时或过夜 孵育

蛋白免疫印迹杂交（Western Blot）技术手册

蛋白免疫印迹杂交（Western Blot. WB）是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离，再转移到杂交膜（blot）上，然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。WB是进行蛋白质分析最流行和成熟的技术之一。

本指南讨论Western Blot操作方法及常见问题分析，有助于成功完成WB。 A 蛋白样本提取制备

1 细胞或组织裂解

2 蛋白酶和磷酸酶抑制剂 3 蛋白定量

4 电泳上样样品的准备 B 电泳

1 PAGE胶的制备 2 蛋白分子量Marker 3 阳性对照 4 内参对照 5 上样与电泳

C 转膜与显色（Western Blot）

1 胶中蛋白的检测 2 蛋白转膜

3 膜上蛋白的检测：丽春红 4 膜的封闭 5 一抗的孵育 6 二抗的孵育 7 显色

D 常见问题分析与解决方案

附录1 WB实验试剂配制方法 附录2 SDS-PAGE胶的配制

1

WB概述:检测原理

Western Blot过程示意图

聚丙烯酰胺凝胶电泳

转膜

封闭

孵育1小时或过夜 孵育一抗 孵育1小时或过夜 孵育

分 子 植 物 病 理 学 实 验

--Southern杂交

（同位素标记，防止污染！注意物品的放置与处置，检测！）

核酸分子杂交技术是分子生物学领域中最常用的基本技术方法之一。其基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下（适宜的温度及离子强度等）可按碱基互补原则退火形成双链，杂交的双方是待测核酸序列及探针。膜上印迹杂交是指待测核酸序列片段结合到一定的固相支持物，然后与存在于液相中标记的核酸探针进行杂交的过程，是目前最常用的一种核酸分子杂交方法。其操作基本流程是：首先用凝胶电泳方法将待测核酸片段分离，然后用印迹技术将分离的核酸片段转移到特异的固相支持物上，转移后的核酸片段将保持其原来的相对位置不变。再用标记的核酸探针与固相支持物上的核酸片段进行杂交。最后洗去未杂交的游离的探针分子，通过放射自显影等检测方法显示标记的探针的位置。由于探针已与待测核酸片段中的同源序列形成杂交分子，探针分子显示的位置及其量的多少，则反映待测核酸分子中是否存在相应的基因顺序及其量与大小。Southern印迹是指将电泳分离的DNA片段转移到一定的固相支持物上的过程。（目的：分析遗传位点、拷贝数；多态性；来源；文库分析；基因敲除；亚克隆；基因分离与检测等 ）

Southern杂交

Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNA片段，将胶上的DNA变性并在原位将单链DNA片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上，经干烤或者紫外线照射固定，再与相对应结构的标记探针进行杂交，用放射自显影或酶反应显色，从而检测特定DNA分子的含量 基本原理是：具有一定同源性的两条核酸单链在一定的条件下，可按碱基互补的原则形成双链，此杂交过程是高度特异的。由于核酸分子的高度特异性及检测方法的灵敏性，综合凝胶电泳和核酸内切限制酶分析的结果，便可绘制出DNA分子的限制图谱。

Southern印迹杂交技术包括两个主要过程：一是将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，即印迹（blotting）；二是固定于膜上的核酸同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。该技术是1975年英国爱丁堡大学的E.M.Southern首创的，Southern印迹杂交故因此而得名。

Northern 印记杂交 Northern blot 是一种通过检测RNA的表达水平来检测基因表达的方法，通过northern blot的方法可以检

Southern Blotting技术总结

Southern Blotting溶液的配制： ※、变性缓冲液

1.5M NaCl 0.5M NaOH ※、中和缓冲液

1.5M NaCl 1.0 MTris?HCl Tris,HCl调pH8.0 ※、20×SSC 1L

3.0 M NaCl 0.3 M 柠檬酸钠 pH7.0) ※、2×SSC:

0.3 M NaCl, 0.03 M 柠檬酸钠(pH7.0) ※、洗膜液Ⅰ的配制： 2×SSC，0.1%SDS ※、洗膜液Ⅱ的配制： 0.5×SSC，0.1%SDS ※、Washing Buffer:

0.1 M Maleic Acid，0.15 M NaCl（pH7.5）,0.3%(V/V) Tween ※、Maleic Acid Buffer：0.1M Maleic Acid，0.15 M NaCl（pH7.5） ※、1×Blocking Solution：10×Blocking Solution(vial6),用Maleic Acid Buffer稀释10倍（现配现用）；

※、Antibody solution:每次使用前，4℃,10000rpm

3 Western blot

3.1 试剂配制

1）30%聚丙烯酰胺储备液（Acr/Bis）：

丙烯酰胺（Acr），29g；N,N-亚甲基双丙烯酰胺（Bis），1g，去离子水溶解，37℃水浴助溶，定容至100mL。0.45μm滤器过滤，棕色瓶4℃避光保存。 2）10%十二烷基硫酸钠（SDS）：

SDS，10g；H2O，80mL。68℃加热溶解，浓HCl调pH至7.2，定容至100mL，室温保存。

3）10%过硫酸铵（AP）：

AP，1g；H2O，10mL。避光，4℃保存。（4℃2周） 4）分离胶缓冲液（1.5MTris-HCl pH8.8）：

Tris，18.17g；H2O 80mL。用浓HCl调pH至8.8，定容至100mL，4℃保存。 5）浓缩胶缓冲液（1.0MTris-HCl pH6.8）：

Tris，12.11g；H2O 80mL。用浓HCl调pH至6.8，定容至100mL，4℃保存。 6）电泳缓冲液（10×）：

甘氨酸（Glycine），188g；Tris 30.2g；SDS，10g；H2O，800mL。调节pH至8.3，定容至1L，4℃保存（用时稀释为1×）。 7）5×SDS-PAGEloadingBuffer（5mL）：

1MT

人的一生，就像一条漫长的道路，而一次次的成长，就是这条路上的一朵朵鲜花。现在，让我们欣赏一下我成长道路上开得最艳的那朵花儿吧。

记得那是一个风和日丽的下午，我的肚子咕咕直叫，好饿啊～我要饿死了”没办法，人是铁，饭是钢啊。我赶紧起身，马上奔到客厅，费尽口舌地央求爸爸，可是爸爸眼珠一转，对我说：你是个大孩子了，应该自己想办法解决问题了哦。”

那么我该做什么呢？”先从最简单的开始学好了，有了，你就做荷包蛋吧”。可是”我小声地嘀咕着，心里也打起了退堂鼓。正当我想退缩的时候，咕咕咕的声音又响起来了：求你了老兄，你可以的，大胆的尝试吧！”唉～没办法了，我只好去冒险”一把了。

人人都说万事开头难”，对我来说也是如此。我按爸爸教给我的操作流程，作文先小心翼翼的把油倒进锅里，开了火，等油热了以后，轻轻地敲开蛋壳，把蛋液倒进锅里，之后，我迅速缩回了手，生怕油溅到我身上。正当我以为一切都妥当了的时候，锅里冒出了一股烟，我急忙凑过去看。坏了，原来我忘了将荷包蛋翻面了。我急忙将荷包蛋铲出锅，天啊！一面是白白的孩儿脸”，而另一面是煎的不能再糊的老人脸”。我又

成长的印迹

暑期,应老师的要求读了《钢铁是怎样炼成的》这本书,它使我爱不释手。保尔柯察金那顽强的品格多么令人敬佩!如果你读了这本书,就会明白具有钢铁品格的人是“大写”的人。

保尔一生十分坎坷，在双目失明的情况下，他坚持写书，对自己毫无顾惜，书中写道：他呕心沥血写的稿件丢失了，多么令他灰心失望啊，但他重新振作起来，用顽强的毅力完成了巨著。书中有段名言脍炙人口：“人的生命是最宝贵的，当他回首往事的时候，不应该为碌碌无为二悔恨…….”保尔可谓强者的化身，拥有永不退缩的恒心、自立却不自负的心态和对世界充满无限的爱。

对照保尔，想想自己。岁月随云散，成长入海流。渐渐地我已长大，成长的路途崎岖、坎坷，在无数次的跌倒后面，都有一个微笑支持着，总有一个不肯低下的高傲的头说“相信自己，我是最棒的！”就是这句话，一直激励着我，让我风雨无阻，勇往直前。它使我知道，要等上胜利的顶峰，除了辛勤的努力外，钢铁般的毅力同样不可少。

成长的脚印一直在坚持、永不退缩。没有不下雨的天，没有风平浪静的海面。成长的路走不完，没有尽头，这需要我们不断努力，不断进取，不断坚持，才有可能看到成功的曙光，胜利的希望。而这一切都是那么遥远，所以成功的果实需要我们用知识播种，用汗水浇灌，用毅力普照，才

1.4.9 细胞裂解液

50mM Tris-Cl (pH 8.0) ，1% NP-40， 150mM NaCl，0.5%去氧胆酸钠及0.1% SDS

1.4.10 PMSF储存液（100mmol/L）

称取PMSF17.4mg,溶于1ml异丙醇，分装后储存于－20℃。 1.4.11 5×Tris甘氨酸电泳缓冲液

去离子水 500ml，Tris碱 15.1g，甘氨酸 94g，10%(w/v)电泳级SDS 50ml，补去离子水至1000ml，使用前做5×稀释。

1.4.12转膜缓冲液

Tris碱 3.03g，甘氨酸 14.4g，甲醇 200ml，补ddH2O 至1000ml , 每次配完可用2～3 次，现用现配。4℃避光保存。 1.4.13 1.5MTris－HCl(PH8.8)

Tris碱18.17g,ddH2O 80ml,浓HCL调PH8.8，定容100ml。 1.4.14 1.0MTris－HCl（PH6.8）

Tris碱12.11g,ddH2O 80ml,浓HCL调PH6.8，定容100ml。 1.4.15 10%SDS

SDS 10g，ddH2O定容100ml。 1.4.16 30%丙烯酰胺（29：1）

Western blot（蛋白印迹法）详细步骤

一、 组织的研磨

准备：研钵、研磨棒、EP管、药匙、液氮、液氮匙、自封袋、一次性手套、棉手套 步骤：①用研磨棒将装有冻存组织的EP管敲碎，取出组织，在研钵中盛满液氮，用力敲碎组织，研磨。

②研磨过程中一旦液氮干了，立即加入液氮，保持研磨在液氮中进行，直至组织呈干粉状。

③用在液氮中浸泡过的药匙将研磨好的粉末盛入新的EP管中。 ④装有组织粉末的EP管现在液氮中保存，待所有组织都研磨结束后装入自封袋，于-80℃保存。

注意：1.研钵使用前要用锡纸包口、研磨棒用锡纸包头，在烘箱中烘烤180℃至少3h以上。

2.组织研磨成粉末后待液氮全部挥发后再将组织粉末装管。 3.每种样品都最好留有副管，备用。

二、 裂解提蛋白

准备：裂解液配制比例 RIPA:PMSF=1000：10=100：1

若需要加入蛋白酶抑制剂，则比例一般为1:1000（即1ml裂解液加1μl蛋白酶抑制剂）

步骤：①将RIPA和PMSF按比例混匀，加入到装有组织粉末的EP管中，一般加入300~500μl左右（浓度尽量高点）。

②盖好盖子，在冰上裂解30~40