ctab法提取植物基因组dna
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实验二 植物基因组DNA的提取笔记
实验二 植物基因组DNA的提取
Tris 读音 “吹斯” 脱氧核糖核酸酶DNase
是一种可以消化单链或双链DNA产生单脱氧核苷酸或单链或双链的寡脱氧核苷酸的核酸内切酶DNase I活性依赖于钙离子,并能被镁离子或二价末端,或1-2个核苷酸突出的粘末端。 淀下来,而DNA溶解在溶液中。
锰离子激活。镁离子存在条件下,DNase I可随机剪切双链DNA的任意位点;二价锰离子存在条件下,DNase I可在同一位点剪切DNA双链,形成平
苯酚在空气中经常被氧化生成醌,它能够产生自由基,直接用于DNA分离,会使磷酸二酯键断裂, 造成DNA降解。苯酚使蛋白变性,离心时沉
在提取DNA时用的原料成分的关系,很多植物源提取材料里面含有酚类物质,酚类物质是芳族环上的氢原子被羟基或功能衍生物取代后生成的化合物
酚类物质如果经氧化后就会很容易于DNA共价结合引起褐变.这就是褐变现象,为有效除去酚类物质,需要在研磨时加入抗氧化的PVP,用PVP是利用
它的“CO-N=”基有很强的结合多酚化合物的能力,其结合能力随多酚化合物中芳环羟基数量的增加而加强,结合成复合物后,通过离心除去。另外,在化合物被氧化。
加入提取液时,加入B-巯基乙醇可使多酚氧化酶失活,防止酚类物质
2×CTAB法植物总DNA提取
2×CTAB法植物总DNA提取
1. 液氮研磨1g左右的植物组织,转移到离心管中。改用研磨枪在冰上研磨,不加β-巯基乙醇
研磨时可加入适量的PVP、β-巯基乙醇。若CTAB准备2-3天内用完,则可将PVP、β-巯基乙醇直接加入其中。
2. 加入500μl的2*CTAB (60℃或65℃预热) ,颠倒混合均匀后在60℃或65℃水浴30m-1h小时,其间要上下颠倒混匀数次。
3.取出离心管,加入等体积的24:1(三氯甲烷:异戊醇),上下颠倒充分混合。 若量多,则可以直接侧立于摇床上晃动10分钟。
4.12000转速离心5-10min。将离心管动作轻缓的取出转子,放置于离心管架上。 a.离心后溶液分三层:上层为水相;中层为碎片和蛋白相;底层为氯仿 b.迅速进入下一步,以免各相混合
5.用移液枪吸取管中上层水相,动作一定要轻缓,不可搅动其它两层。 a.此步骤要宁舍不贪多,尽量避免吸取到下层液体。
b.若上步骤中中间层较厚,则继续加入等体积24:1,再次抽提一次,直至中间层较薄。 6. 在抽提出的水相中加入1/3体积的5M的KAc及等体积的异丙醇(4℃预冷),轻轻晃动混合均匀后在-20℃沉淀。沉淀至少15分钟至过夜。
6-1 在抽提出的水
CTAB配方及植物DNA提取方法
主要试剂的配制
参考(美)萨姆布鲁克(Sambrook,J.)等.分子克隆实验指南(下册)配置如下[94]:
(1)0.5 mo1/L EDTA(pH 8.0):称取EDTA-Na2 18.61 g,加80 mL双蒸水,磁力搅拌器上剧烈搅拌。加入7 mL 10 mo1/L NaOH调至pH 8.0再用双蒸水定容到100 mL,在1.03×105Pa下高压灭菌20 min。
(2)5 mol/L NaCl溶液:称取NaCl 29.22 g,溶解于90 mL的双蒸水,加热到80℃溶解,冷却,再用双蒸水定容100 mL,在高压灭菌20 min。
(3)10 mol/L NaOH溶液:称取40.00 g NaOH溶于80 mL的双蒸水,搅拌,定容到100 mL。 (4)1 mol/L Tris-HC1溶液(pH 8.0):称取12.114 gTris碱,溶于80 mL的双蒸水,加入浓HC1 4.2 mL,调整PH值到8.0,加水定容到100 mL,高压灭菌20min。 (5)10%CTAB(m/v):称取CTAB 10.00 g,溶解于80 mL的双蒸水,加热促进溶解,加双蒸水定容到100 mL,室温保存。
(6)5 mo1/L KAc溶液(pH 4
CTAB法提取DNA原理及步骤、制胶、电泳
CTAB法提取DNA的原理及步骤:
冷冻的植物组织,在低温干燥状态下机械磨碎。通常精提DNA,都要加液氮使材料变脆,易于研磨。低温降低了DNase的活性,利用CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)去污剂溶解细胞膜,使核蛋白等解聚,使DNA游离出来。
CTAB作为一种阳离子去污剂,可溶解细胞膜,与核酸形成复合物,可使核酸沉淀出来。通过离心将CTAB-核酸复合物语糖类、蛋白质等分离开来。随后将复合物溶于高盐溶液中,再加乙醇使核酸沉淀,而CTAB溶于乙醇,从而去除CTAB 。
1.研磨
2.加1000ul预处理液,10-15min,4000r,10min,弃上清(重复) 预处理液:Tris-hcl (PH8.0) 提供缓冲环境,防止核酸被破坏。 EDTA (螯合二价阳离子)0.5M 抑制DNase活性。 Nacl 5M 提供高盐环境,使DNA充分溶解。 β-巯基乙醇 抗氧化剂,去除酚,糖,能与酚形成
CTAB法提取DNA原理及步骤、制胶、电泳
CTAB法提取DNA的原理及步骤:
冷冻的植物组织,在低温干燥状态下机械磨碎。通常精提DNA,都要加液氮使材料变脆,易于研磨。低温降低了DNase的活性,利用CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)去污剂溶解细胞膜,使核蛋白等解聚,使DNA游离出来。
CTAB作为一种阳离子去污剂,可溶解细胞膜,与核酸形成复合物,可使核酸沉淀出来。通过离心将CTAB-核酸复合物语糖类、蛋白质等分离开来。随后将复合物溶于高盐溶液中,再加乙醇使核酸沉淀,而CTAB溶于乙醇,从而去除CTAB 。
1.研磨
2.加1000ul预处理液,10-15min,4000r,10min,弃上清(重复) 预处理液:Tris-hcl (PH8.0) 提供缓冲环境,防止核酸被破坏。 EDTA (螯合二价阳离子)0.5M 抑制DNase活性。 Nacl 5M 提供高盐环境,使DNA充分溶解。 β-巯基乙醇 抗氧化剂,去除酚,糖,能与酚形成
CTAB法提取DNA原理及步骤、制胶、电泳
CTAB法提取DNA的原理及步骤:
冷冻的植物组织,在低温干燥状态下机械磨碎。通常精提DNA,都要加液氮使材料变脆,易于研磨。低温降低了DNase的活性,利用CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)去污剂溶解细胞膜,使核蛋白等解聚,使DNA游离出来。
CTAB作为一种阳离子去污剂,可溶解细胞膜,与核酸形成复合物,可使核酸沉淀出来。通过离心将CTAB-核酸复合物语糖类、蛋白质等分离开来。随后将复合物溶于高盐溶液中,再加乙醇使核酸沉淀,而CTAB溶于乙醇,从而去除CTAB 。
1.研磨
2.加1000ul预处理液,10-15min,4000r,10min,弃上清(重复) 预处理液:Tris-hcl (PH8.0) 提供缓冲环境,防止核酸被破坏。 EDTA (螯合二价阳离子)0.5M 抑制DNase活性。 Nacl 5M 提供高盐环境,使DNA充分溶解。 β-巯基乙醇 抗氧化剂,去除酚,糖,能与酚形成
真核生物基因组DNA的提取和含量测定--上传用 - 图文
实验报告 真核生物基因组DNA的提取和含量测定 实验一、真核生物基因组DNA和提取和含量测定 姓 名:—— 一、实验原理(Principle) (一)基因组DNA的提取: 本实验选用小鼠肝脏细胞作为实验材料,采用匀浆法破碎组织获得细胞,用无菌水溶解沉淀,加入蛋白酶消化液,以温和方法的破碎细胞而不产生机械剪切以致破坏DNA的完整性,可以使DNase变性,去除部分的蛋白,还可以使核蛋白体从DNA上解离。然后加入RNase以去除RNA。再用苯酚:氯仿抽提法反复抽提,使DNA进入水相与蛋白质组分分开,收集上清液后用乙醇沉淀DNA,最后用TE缓冲液溶解DNA,并测定DNA的含量及纯度。 苯酚—氯仿抽提法:酚、氯仿是有机溶剂,能有效地使蛋白质变性,使用酚:氯仿混合物抽提,可促进有机相和水相的分离。异戊醇则可减少操作过程中产生的气泡。变性蛋白一般集中在两相之间的界面层,而脂类则有效地分配在有机相中,核酸则被留于上层水相。该法具有①操作条件比较温和;②能迅速使蛋白质变性并同时抑制核酸酶的活性;③可得到具有生物活性的高聚合度的核酸等优点。但其操作步骤较为繁琐,去除蛋白质需要反复多次,费时,且所得到的核酸仍有部分降解。 (二)二苯胺显色法测定DN
实验一 全基因组DNA的分离及纯化
基因组DNA分离及纯化
实验一 全基因组DNA的分离及纯化 由于分离线粒体DNA繁琐、耗时、成本相对较高,目前很多研究采用先分的全基因组DNA,再用特异的引物扩增线粒体基因组的方法,因此获得高纯度全基因组DNA显得尤为重要。
现在有很多的商品化试剂盒可以快速高效的从血液,组织中提取基因组DNA,简便快捷,DNA的得率和纯度都很高 。我们就TaKaRa DNA提取试剂盒为例,介绍外周静脉血全基因组DNA提取的操作流程。
目的:掌握试剂盒提取外周血细胞基因组DNA的方法。
原理:本试剂盒是用于动物组织、植物材料、全血和培养细胞(Animal tissues/Plants/Blood/Cultured cells)等全基因组DNA的广谱型小量纯化试剂盒。该试剂盒采用独特的细胞裂解系统,由细胞裂解液裂解细胞释放基因组DNA,然后使用特殊的相分离法除去蛋白质、多糖以及脂质等杂质,再结合DNA制备膜技术纯化基因组DNA。本试剂盒具有高效、快速、方便之特点,全套操作约需1小时便可完成。使用本试剂盒可从1~100 mg的动物组织、10~200 mg的植物材料、10~200 μl的全血(含抗凝剂)、10~10的培养细胞中纯化得到多至数十微克的高纯度基因组DNA。此基
植物DNA的提取
综合性实验设计
——植物DNA的提取及纯度检验方案
班级 组别 成员 指导教师 10级生物科学2班 第七组 刘梦雅、王芳、毛阿威、张杰 刘立亚
2011年11月11日
综合性实验设计
——植物DNA的提取及纯度检验方案
一、 实验目的
1. 学习从生物体中分离核酸的原理和方法; 2. 掌握测定核酸的原理和方法;
3. 掌握核酸的琼脂糖凝胶电泳的原理和方法;
4. 培养学生创新实践能力和团队合作精神,并强化科研反哺教学效果。
二、 实验原理
1、 关于植物DNA制备的基本原理
植物细胞中DNA主要存在于细胞核内,称为核DNA。细胞质中含有少量的DNA,称之为细胞质DNA,主要分布于线粒体或叶绿体中,分别称为线粒体DNA和叶绿体DNA,细胞内各种DNA称为总DNA。植物DNA的制备,必须首先注意植物细胞的特点:①植物组织中含有坚硬的纤维素,采用温和条件难以破碎细胞;②植物细胞一般具有大的液泡,破碎细胞时有机酸随之逸出将使pH显著下降;③通常植物细胞的DNA含量较低;④植物中含有大量多糖、脂质、色素和酚类等物质,这些杂质往往会与提取的DNA混在一起,给核酸的提取与纯化带来诸多不便。鉴于以上特点,提取植物DNA时除了选
植物DNA的提取
综合性实验设计
——植物DNA的提取及纯度检验方案
班级 组别 成员 指导教师 10级生物科学2班 第七组 刘梦雅、王芳、毛阿威、张杰 刘立亚
2011年11月11日
综合性实验设计
——植物DNA的提取及纯度检验方案
一、 实验目的
1. 学习从生物体中分离核酸的原理和方法; 2. 掌握测定核酸的原理和方法;
3. 掌握核酸的琼脂糖凝胶电泳的原理和方法;
4. 培养学生创新实践能力和团队合作精神,并强化科研反哺教学效果。
二、 实验原理
1、 关于植物DNA制备的基本原理
植物细胞中DNA主要存在于细胞核内,称为核DNA。细胞质中含有少量的DNA,称之为细胞质DNA,主要分布于线粒体或叶绿体中,分别称为线粒体DNA和叶绿体DNA,细胞内各种DNA称为总DNA。植物DNA的制备,必须首先注意植物细胞的特点:①植物组织中含有坚硬的纤维素,采用温和条件难以破碎细胞;②植物细胞一般具有大的液泡,破碎细胞时有机酸随之逸出将使pH显著下降;③通常植物细胞的DNA含量较低;④植物中含有大量多糖、脂质、色素和酚类等物质,这些杂质往往会与提取的DNA混在一起,给核酸的提取与纯化带来诸多不便。鉴于以上特点,提取植物DNA时除了选