酵母双杂交原理与实验具体流程

模块七 蛋白质之间的相互作用

1. 实验目的

本实验以重组质粒和酵母细胞为材料，学习检测蛋白质相互作用的基本原理和技术方法。主要介绍酵母双杂交的基本原理与操作技术；让学生了解和掌握酵母双杂交系统的应用；掌握酵母感受态的制备的基本原理和主要的操作步骤。 2. 实验原理

1989年Fields和Song等人根据当时人们对真核生物转录起始过程调控的认识（即细胞内基因转录的起始需要转录激活因子的参与），提出并建立了酵母双杂交系统。该系统作为发现和研究活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平台，近几年得到了广泛的运用和发展。

相比于其它蛋白质筛选系统，酵母双杂交系统具有以下优点：（1）检测在真核活细胞内进行，在一定程度上代表细胞内的真实情况。（2）作用信号是在融合基因表达后，在细胞内重建转录因子的作用而给出的，省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。（3）检测结果是基因表达产物的积累效应，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱或暂时的相互作用。（4）酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA 文库，能分析细胞质、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能蛋白。（5） 通过mRNA 产生多种稳定的酶使信号放大。同时，酵母表型、X-Gal

模块七 蛋白质之间的相互作用 1. 实验目的

本实验以重组质粒和酵母细胞为材料, 学习检测蛋白质相互作用的基本原理和技术方法。 主要介 绍酵母双杂交的基本原理与操作技术; 让学生了解和掌握酵母双杂交系统的应用; 掌握酵母感受态的 制备的基本原理和主要的操作步骤。

2. 实验原理

1989年 Fields 和 Song 等人根据当时人们对真核生物转录起始过程调控的认识(即细胞内基因转 录的起始需要转录激活因子的参与 ,提出并建立了酵母双杂交系统。该系统作为发现和研究活细胞 体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平台,近几年得到了广泛的运用和发展。

相比于其它蛋白质筛选系统,酵母双杂交系统具有以下优点:(1检测在真核活细胞内进行,在 一定程度上代表细胞内的真实情况。 (2作用信号是在融合基因表达后,在细胞内重建转录因子的作 用而给出的,省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。 (3检测结果是基因表达产物的积累效应,因而可检测 存在于蛋白质之间的微弱或暂时的相互作用。 (4酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型 和分化时期材料构建 cDNA 文库,能分析细胞质、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功 能蛋白。 (5 通过 mRNA 产生多种稳定的酶

酵母双杂交相关实验方法

一、 酵母总DNA的提取方法（蜗牛酶法） 1、 酵母质粒提取试剂

Buffer I 0.9 mol/L Sorbitol 0.1mol/L EDTA Buffer II 50mM/L Tris 20mM/L EDTA Buffer III 10mM/L Tris 1Mm/L EDTA 2、 操作步骤：

(1) 收集新鲜菌体重加入150μl buffer I，25μl 蜗牛酶（30mg/ml）。. (2) 37℃水浴1h。

(3) 10000rpm离心10min，去上清，沉淀中加入250μl buffer II。 (4) 加入25μl 10% SDS，65℃ 水浴30min，每间隔5min中震荡一次。 (5) 加入25μl 5mol/L 醋酸钾，冰浴60min。 (6) 4℃12000rpm离心15min，取上清。

(7) 在上清中加入2-3倍体积的无水乙醇，混匀静置于-20℃，1小时以上。 (8) 取出，4℃12000rpm离心15min ，弃上清。

(9) 加入150μl

4月4日划线配培养基 TE/LIAC PEG/LIAC

配置培养基（YPD YPDA）取酵母细胞划线 30° 生长3天。 需要用品：三角瓶灭菌封口膜酵母提取物蛋白胨

注：以下所有涉及菌的操作均需在超净台中完成。 4月6号星期三

（1） 选择2-3mm的单克隆（枪头吸取）放入3-5ml的YPDA液体培养基，30°摇菌200rpm，8h

7号下午开始，过夜培养，次日若菌液浓度达到标准，可先置于4度冰箱保存。

需要用品：200ul灭菌枪头、50ml三角瓶、YPDA液体培养基、摇床。

4月7号星期四

（2） 吸取2.5-10ul酵母培养液，加入25mlYPDA液体培养基，摇菌16-20h直到OD值0.15-0.3。

下午4点开始 8号 8点结束

Tips：由于第一次活化的菌夜浓度不一，此处建议设置梯度，分别取2.5、5、10 ul酵母培养液，加入25ml YPDA液体培养基（转化5个以下质粒的话，25ml菌量就够后续使用）。

4月8号星期五

（3） 将菌液转移至灭菌的50ml离心管中，用天平配平后，室温下700g离心5分钟。

（4） 弃掉上清，加入50ml新鲜的YPDA液体重悬菌体（由于离心转速较低，沉淀易悬起来，故倒

掉上清液时要小心

4月4日划线配培养基 TE/LIAC PEG/LIAC

配置培养基（YPD YPDA）取酵母细胞划线 30° 生长3天。 需要用品：三角瓶灭菌封口膜酵母提取物蛋白胨

注：以下所有涉及菌的操作均需在超净台中完成。 4月6号星期三

（1） 选择2-3mm的单克隆（枪头吸取）放入3-5ml的YPDA液体培养基，30°摇菌200rpm，8h

7号下午开始，过夜培养，次日若菌液浓度达到标准，可先置于4度冰箱保存。

需要用品：200ul灭菌枪头、50ml三角瓶、YPDA液体培养基、摇床。

4月7号星期四

（2） 吸取2.5-10ul酵母培养液，加入25mlYPDA液体培养基，摇菌16-20h直到OD值0.15-0.3。

下午4点开始 8号 8点结束

Tips：由于第一次活化的菌夜浓度不一，此处建议设置梯度，分别取2.5、5、10 ul酵母培养液，加入25ml YPDA液体培养基（转化5个以下质粒的话，25ml菌量就够后续使用）。

4月8号星期五

（3） 将菌液转移至灭菌的50ml离心管中，用天平配平后，室温下700g离心5分钟。

（4） 弃掉上清，加入50ml新鲜的YPDA液体重悬菌体（由于离心转速较低，沉淀易悬起来，故倒

掉上清液时要小心

酵母双杂交（筛库）

pGBK-gene 转化酵母

1. 酵母细胞（AH109）划线，YPDA平板，30°C烘箱培养18-20小时。

2. 挑取单细胞菌落，在YPDA培养基中，30°C摇床培养18-20小时至菌液饱和。

3. 次日，取饱和的酵母培养液5ml转接至100mlYPDA培养基中，30°C摇床培养2h，测

定OD600，直至OD600达到0.5左右。 4. （超净台下工作，下同）将上述菌液分装在2只50ml离心管（灭菌）中，室温下3000rpm

离心5min。

5. 弃上清，重悬于20ml无菌水中，3000rpm离心5min。

6. 弃上清，重悬于10ml 1×TE/LiAc溶液中，3000rpm离心5min。 7. 弃上清，重悬于500μl 1×TE/LiAc溶液中，室温温育10min。

8. 取eppendorf管，每管加100μl酵母细胞、5μl鲑鱼精DNA（10mg/ml，用之前沸水煮

2-3min，立即放冰上）、15μl DNA（pGBK连接的基因）。 9. 加入280μl PEG/LiAc 溶液，30°C放置45min（可摇）。 10. 42°C热激10min，立即放冰上2min。

11. 室温下6000-8000rpm离心20

yeast two hybrid 的protocol

介绍

试剂盒物品清单

额外附加物品列表

酵母菌株

酵母载体

方法简述：单杂交文库的构建和筛选

方法简述：双杂交文库的构建和筛选

（七） 构建用于酵母单杂交的报告质粒载体

（八） 构建用于酵母双杂交的DNA-BD融合载体

（九） 构建生成cDNA文库

（十） 构建和筛选酵母单杂交和双杂交文库（简述）

（十一） 酵母单杂交文库的构建和筛选

（十二） 酵母双杂交文库的构建和筛选

方法A:通过酵母配对（Yeast Mating）来筛选目的蛋白

方法B:通过共转化的方法筛选目的蛋白

（十三） 分析阳性相互作用结果

（十四） 问题解决指南

（十五） 参考文献

（十六） 相关产品

附录A: 双链 cDNA合成的典型结果

附录B: 酵母感受态的制备—LiAc 法

附录C： 单杂交对照载体信息

附录D： 双杂对照载体信息 目录 （一） （二） （三） （四） （五） （六） 4 7 9 11 14 16 17 18 19 21 27 28 30 30 35 38 44 47 50 51 52 53 54 表格列表

（酵母菌储存在-70℃中，引物和质粒DNA储存在-20℃中） 概念：

1. 次序转化:指的是先将一种质粒转化进酵母中（常是DNA-BD/bait plasmid），在选择培养基中选择出阳性克隆，之后再将另外一个质粒（AD fusion library）转化进去。优点：就是比共转化使用更少的质粒DNA，也就是节约质粒DNA。

2. 共同转化：将两种质粒一起转化进酵母中。优点：比次序转化更容易操作。 pGBKT7----的选择物是：kanamycin（卡那霉素）？ pGADT7----的选择物是：ampicillin (氨苄西林) ？

各种SD培养基：

1) SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-his （组氨酸）(1000 ml) （？

“四缺”）

酵母氮源（YNB）：6.7g ;

-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.60g （购买来就配好的） ; 葡萄糖 20g (即2%)

2) SD/-leu/-trp/-his (1000 ml)

酵母氮源（YNB）：6.7g ;

-leu/-trp/-his DO supplement 0.62g ;

（酵母菌储存在-70℃中，引物和质粒DNA储存在-20℃中）

概念：

1. 次序转化:指的是先将一种质粒转化进酵母中（常是DNA-BD/bait plasmid），在选择培养基中选择出阳性克隆，之后再将另外一个质粒（AD fusion library）转化进去。优点：就是比共转化使用更少的质粒DNA，也就是节约质粒DNA。

2. 共同转化：将两种质粒一起转化进酵母中。优点：比次序转化更容易操作。

pGBKT7----的选择物是：kanamycin（卡那霉素）

pGADT7----的选择物是：ampicillin (氨苄西林)

各种SD培养基：

1)SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-his （组氨酸）(1000 ml)（“四

缺”）

酵母氮源（YNB）： ;

-ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.60g （购买来就配好的） ;

葡萄糖20g (即2%)

2)SD/-leu/-trp/-his (1000 ml)

酵母氮源（YNB）： ;

-leu/-trp/-his DO supplement 0.62g ; （购买来就配好的）

葡萄糖 20g. (即2%)

3)SD/-leu/-trp (1000

酵母单杂分析

酵母单杂交技术是体外分析DNA与细胞内蛋白质相互作用的一种方法，通过对酵母细胞内报告基因表达状况的分析来鉴别DNA结合位点并发现潜在的结合蛋白基因，或对结合位点进行分析。运用此技术能筛选到与DNA结合的蛋白质，并可直接从基因文库中得到编码该蛋白质的核苷酸序列而无需复杂的蛋白质分离纯化操作，故在蛋白质研究中具有一定的优势；而且酵母属真核细胞，通过酵母系统得到的结果比其它体外技术获得的结果更能体现真核细胞内基因表达调控的情况。 【实验目的】

了解酵母单杂交的基本原理和应用，掌握酵母单杂交的主要步骤及注意事项，学会酵母感受态的制作与转化，基因文库的构建及筛选。 【实验原理】

酵母单杂交方法是根据DNA结合蛋白（即转录因子）与DNA顺式作用元件结合调控报告基因表达的原理来克隆编码目的转录因子的基因（cDNA）。该方法也是细胞内分析鉴定转录因子与顺式作用元件结合的有效方法。如图所示，将已知的特定顺式作用元件构建到最基本启动子（minimal promoter，Pmin）上游，Pmin启动子下游连接报告基因。进行cDNA融合表达文库时，编码目的转录因子的cDNA融合表达载体被转化进入酵母细胞后，其编码产物（转录因子）与顺式作用元件结合，就可