蛋白免疫印迹杂交实验

蛋白免疫印迹杂交（Western Blot）技术手册

蛋白免疫印迹杂交（Western Blot. WB）是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离，再转移到杂交膜（blot）上，然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。WB是进行蛋白质分析最流行和成熟的技术之一。

本指南讨论Western Blot操作方法及常见问题分析，有助于成功完成WB。 A 蛋白样本提取制备

1 细胞或组织裂解

2 蛋白酶和磷酸酶抑制剂 3 蛋白定量

4 电泳上样样品的准备 B 电泳

1 PAGE胶的制备 2 蛋白分子量Marker 3 阳性对照 4 内参对照 5 上样与电泳

C 转膜与显色（Western Blot）

1 胶中蛋白的检测 2 蛋白转膜

3 膜上蛋白的检测：丽春红 4 膜的封闭 5 一抗的孵育 6 二抗的孵育 7 显色

D 常见问题分析与解决方案

附录1 WB实验试剂配制方法 附录2 SDS-PAGE胶的配制

1

WB概述:检测原理

Western Blot过程示意图

聚丙烯酰胺凝胶电泳

转膜

封闭

孵育1小时或过夜 孵育一抗 孵育1小时或过夜 孵育

蛋白免疫印迹杂交（Western Blot）技术手册

蛋白免疫印迹杂交（Western Blot. WB）是将蛋白样本通过聚丙烯酰胺电泳按分子量大小分离，再转移到杂交膜（blot）上，然后通过一抗/二抗复合物对靶蛋白进行特异性检测的方法。WB是进行蛋白质分析最流行和成熟的技术之一。

本指南讨论Western Blot操作方法及常见问题分析，有助于成功完成WB。 A 蛋白样本提取制备

1 细胞或组织裂解

2 蛋白酶和磷酸酶抑制剂 3 蛋白定量

4 电泳上样样品的准备 B 电泳

1 PAGE胶的制备 2 蛋白分子量Marker 3 阳性对照 4 内参对照 5 上样与电泳

C 转膜与显色（Western Blot）

1 胶中蛋白的检测 2 蛋白转膜

3 膜上蛋白的检测：丽春红 4 膜的封闭 5 一抗的孵育 6 二抗的孵育 7 显色

D 常见问题分析与解决方案

附录1 WB实验试剂配制方法 附录2 SDS-PAGE胶的配制

1

WB概述:检测原理

Western Blot过程示意图

聚丙烯酰胺凝胶电泳

转膜

封闭

孵育1小时或过夜 孵育一抗 孵育1小时或过夜 孵育

1.4.9 细胞裂解液

50mM Tris-Cl (pH 8.0) ，1% NP-40， 150mM NaCl，0.5%去氧胆酸钠及0.1% SDS

1.4.10 PMSF储存液（100mmol/L）

称取PMSF17.4mg,溶于1ml异丙醇，分装后储存于－20℃。 1.4.11 5×Tris甘氨酸电泳缓冲液

去离子水 500ml，Tris碱 15.1g，甘氨酸 94g，10%(w/v)电泳级SDS 50ml，补去离子水至1000ml，使用前做5×稀释。

1.4.12转膜缓冲液

Tris碱 3.03g，甘氨酸 14.4g，甲醇 200ml，补ddH2O 至1000ml , 每次配完可用2～3 次，现用现配。4℃避光保存。 1.4.13 1.5MTris－HCl(PH8.8)

Tris碱18.17g,ddH2O 80ml,浓HCL调PH8.8，定容100ml。 1.4.14 1.0MTris－HCl（PH6.8）

Tris碱12.11g,ddH2O 80ml,浓HCL调PH6.8，定容100ml。 1.4.15 10%SDS

SDS 10g，ddH2O定容100ml。 1.4.16 30%丙烯酰胺（29：1）

3 Western blot

3.1 试剂配制

1）30%聚丙烯酰胺储备液（Acr/Bis）：

丙烯酰胺（Acr），29g；N,N-亚甲基双丙烯酰胺（Bis），1g，去离子水溶解，37℃水浴助溶，定容至100mL。0.45μm滤器过滤，棕色瓶4℃避光保存。 2）10%十二烷基硫酸钠（SDS）：

SDS，10g；H2O，80mL。68℃加热溶解，浓HCl调pH至7.2，定容至100mL，室温保存。

3）10%过硫酸铵（AP）：

AP，1g；H2O，10mL。避光，4℃保存。（4℃2周） 4）分离胶缓冲液（1.5MTris-HCl pH8.8）：

Tris，18.17g；H2O 80mL。用浓HCl调pH至8.8，定容至100mL，4℃保存。 5）浓缩胶缓冲液（1.0MTris-HCl pH6.8）：

Tris，12.11g；H2O 80mL。用浓HCl调pH至6.8，定容至100mL，4℃保存。 6）电泳缓冲液（10×）：

甘氨酸（Glycine），188g；Tris 30.2g；SDS，10g；H2O，800mL。调节pH至8.3，定容至1L，4℃保存（用时稀释为1×）。 7）5×SDS-PAGEloadingBuffer（5mL）：

1MT

Western blot实验报告

摘要：目的：学习并掌握western blot分离蛋白及观察方法 方法：western blot 结果：见后文

结论：western blot能很好地分离蛋白 关键词：western blot、分离、小鼠组织、蛋白

Western blot test report

Abstract: objective: Learn and master the western blot protein isolated and observation method Methods: western blot：,sds-page and electric transfer Results: see below

Key words: Western blot、separate、mouse tissues、protein

前言:免疫印迹又称Western印迹(Western blotting)，与DNA的Southern印迹技术

相对应，两种技术均把电泳分离的组分从凝胶转移至一种固相载体(通常为NC膜)，然后用探针检测特异性组分。不同的是，Western blotting所检测的是抗原类蛋白质成分，所用的探针是抗体，它与附着于固相

抗核抗体谱检测试剂盒（条带免疫印迹法）

适用范围：用于体外定性检测人血清中抗Mi-2、Ku、U1RNP、Sm、SSA/60kd、SSA/52kd、SSB、Scl-70、PM/Scl、Jo-1、CENP B、PCNA、dsDNA、核小体、组蛋白、P0和AMA M2的IgG抗体。

1.1. 包装规格

20人份/盒

1.2. 型号

型号为ANA-17-H；ANA-15M-H；ANA-15K-H；ANA-13-H；ANA-12-H；ANA-9N-H；ANA-9D-H；ANA-8N-H；ANA-8D-H；ANA-7-H；ANA-5-H

其中，各型号检测项目如下：

表1各型号检测项目

1.3. 主要组成成分表2 主要组成成分

膜条包被抗原型号说明见表3（不同产品型号包被不同抗原组合）表3膜条包被抗原型号说明

2.1. 外观

2.1.1. 试剂盒外部包装盒应整洁，各组分应齐全完整，文字符号标识清晰，所有试剂瓶密闭，无漏液。

2.1.2. 浓缩洗涤缓冲液（5×）为无色澄清液体；酶标液为淡红色澄清液体；底物液为澄清液体。

2.2. 净含量

液体试剂装量不小于标示值。

2.3. 膜条宽度

膜条宽度不低于1.8mm。

2.4. 临界值及重复性

抗核抗体谱企业参考品各检测项目临界值浓度均为15U/ml

Western blot（蛋白印迹法）详细步骤

一、 组织的研磨

准备：研钵、研磨棒、EP管、药匙、液氮、液氮匙、自封袋、一次性手套、棉手套 步骤：①用研磨棒将装有冻存组织的EP管敲碎，取出组织，在研钵中盛满液氮，用力敲碎组织，研磨。

②研磨过程中一旦液氮干了，立即加入液氮，保持研磨在液氮中进行，直至组织呈干粉状。

③用在液氮中浸泡过的药匙将研磨好的粉末盛入新的EP管中。 ④装有组织粉末的EP管现在液氮中保存，待所有组织都研磨结束后装入自封袋，于-80℃保存。

注意：1.研钵使用前要用锡纸包口、研磨棒用锡纸包头，在烘箱中烘烤180℃至少3h以上。

2.组织研磨成粉末后待液氮全部挥发后再将组织粉末装管。 3.每种样品都最好留有副管，备用。

二、 裂解提蛋白

准备：裂解液配制比例 RIPA:PMSF=1000：10=100：1

若需要加入蛋白酶抑制剂，则比例一般为1:1000（即1ml裂解液加1μl蛋白酶抑制剂）

步骤：①将RIPA和PMSF按比例混匀，加入到装有组织粉末的EP管中，一般加入300~500μl左右（浓度尽量高点）。

②盖好盖子，在冰上裂解30~40

第二章 免疫球蛋白

一.单项选择题

1．下列五类Ig的特性哪项是错误的 A

A．IgG是唯一通过胎盘的免疫球蛋白 B.SIgA多为双聚体

C. IgM分子量最大 D.免疫应答过程中产生最早的是IgG

E.正常血清中IgE含量最少 2．Ig分成五类的依据是 B

A.VL抗原特异性的不同 B.VH抗原特异性的不同 C.CL抗原特异性的不同 D.CH抗原特异性的不同 E.CL及CH抗原特异性的不同 3．结合肥大细胞和嗜碱性粒细胞的Ig是 D

A.IgM B.IgG C.IgE D.IgA E.IgD 4． IgE C

A.为单体分子 B.有高度细胞亲和性 C.有CH4区 D.可介导过敏反应 E.以上均可 5．半衰期最长的Ig是 A

A.IgM B.IgE C.IgG D.IgA E.IgD 6．Ig分成各种型及亚型的依据是 A

A.VL抗原特异性的不同 B.VH

第二章 免疫球蛋白

一.单项选择题

1．下列五类Ig的特性哪项是错误的 A

A．IgG是唯一通过胎盘的免疫球蛋白 B.SIgA多为双聚体

C. IgM分子量最大 D.免疫应答过程中产生最早的是IgG

E.正常血清中IgE含量最少 2．Ig分成五类的依据是 B

A.VL抗原特异性的不同 B.VH抗原特异性的不同 C.CL抗原特异性的不同 D.CH抗原特异性的不同 E.CL及CH抗原特异性的不同 3．结合肥大细胞和嗜碱性粒细胞的Ig是 D

A.IgM B.IgG C.IgE D.IgA E.IgD 4． IgE C

A.为单体分子 B.有高度细胞亲和性 C.有CH4区 D.可介导过敏反应 E.以上均可 5．半衰期最长的Ig是 A

A.IgM B.IgE C.IgG D.IgA E.IgD 6．Ig分成各种型及亚型的依据是 A

A.VL抗原特异性的不同 B.VH

酵母双杂交相关实验方法

一、 酵母总DNA的提取方法（蜗牛酶法） 1、 酵母质粒提取试剂

Buffer I 0.9 mol/L Sorbitol 0.1mol/L EDTA Buffer II 50mM/L Tris 20mM/L EDTA Buffer III 10mM/L Tris 1Mm/L EDTA 2、 操作步骤：

(1) 收集新鲜菌体重加入150μl buffer I，25μl 蜗牛酶（30mg/ml）。. (2) 37℃水浴1h。

(3) 10000rpm离心10min，去上清，沉淀中加入250μl buffer II。 (4) 加入25μl 10% SDS，65℃ 水浴30min，每间隔5min中震荡一次。 (5) 加入25μl 5mol/L 醋酸钾，冰浴60min。 (6) 4℃12000rpm离心15min，取上清。

(7) 在上清中加入2-3倍体积的无水乙醇，混匀静置于-20℃，1小时以上。 (8) 取出，4℃12000rpm离心15min ，弃上清。

(9) 加入150μl