慢病毒 侧脑室注射

侧脑室注射

一、大鼠侧脑室注射（需定位器）

SD大鼠，侧脑室的坐标是以前囟点为中心定好坐标，旁开1.5mm，向后囟方向1.1mm ，深4.5mm。 一、实验器具和药品 （一）器具

小号的注射用针头（外径为0.7mm,内径为0.5mm,要磨平，磨光滑，长度大概为1cm，中间套有一小的塑料垫片，以便固定），不锈钢的细铁丝（长度大概为1.2-1.5cm，要求与小号针头的内径相一致，用作导管外的塞子，外面套有与小号的注射用针头粗细一致的塑料，用作塞帽，便于打开），小号螺钉（固定用）和螺丝刀，剪毛剪，镊子，眼科剪（镊），手术刀片（柄），小号注射器，注射针头，烧杯，铝饭盒，手术灯，墨水（作标记），棉签，酒精棉球 （二）药品

生理盐水，青霉素，戊巴比妥钠，H2O2，502胶水，义齿基托树脂，义齿基托树脂液II型

二、实验动物

健康的成年大鼠，体重在170-200g，动物手术前在实验室条件下适应性饲养1周，并于手术前称重，以确定麻醉剂用量。 三、实验步骤 （一）、麻醉

麻醉剂为戊巴比妥钠溶液，浓度为20mg/ml，腹腔注射。体重在170-200g的成年大鼠，注射剂量为0.65ml/只，即可保证整个实验过程动物一直安静。 （二）、固定

1、在一水平桌面上，水平

目的观察微创侧脑室穿刺术联合腰大池穿刺引流术治疗脑出血后脑室铸型的疗效。方法对25例脑室铸型患者采取侧脑室穿刺联合腰大池引流术治疗,观察治疗效果。结果本组无院内死亡病例,1周后院外死亡1例,3～6个月后随防存活患者无脑积水发生。结论侧脑室穿刺术联合腰大池穿刺引流术能有效降低死亡率,明显缩短患者住院时间,清除颅内积血速度较单纯侧脑室穿刺引流术快。

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双侧脑室引流并腰椎穿刺治疗原发性脑室出血临床观察

作者：闫薇 梁洪磊 贺鹏

来源：《中外医疗》2013年第18期

[摘要] 目的 探讨双侧脑室引流与腰椎穿刺联合治疗原发性脑室出血的临床效果。方法 对32例原发性的脑室出血患者实施双侧脑室引流与腰椎穿刺的联并治疗，术后CT复查追踪，观察脑室出血患者的临床疗效。 结果 32例患者中，痊愈28例，植物生存1例，死亡3例，术后出现交通性脑积水5例，行脑室腹腔分流术后恢复良好。术后CT观察患者脑室出血的全部消失时间是5～11 d，时间平均为6.8 d。结论 对原发性患者实施双侧的脑室引流与腰椎穿刺联合治疗，能有效降低患者的脑室出血死亡，增强患者的生命健康，提高生活质量。 [关键词] 双侧；脑室引流；原发性；脑室出血；腰椎穿刺

[中图分类号] R651.1 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2013）06（c）-0097-02 原发性脑室出血可简称为PIVH，所指的是完全在脑室系统中出血，或者在室管膜内1.5 cm区域中的自发出血。PIVH发病率不是很高，在脑室出

慢病毒制备

细胞转染

A）在转染前一天，用胰蛋白酶消化HEK-293T细胞，以含有10%血清的DMEM培养基调整细胞密度为50%-60%，接种到100mm细胞培养皿。 （培养皿提前用polylysine treat 10min，PBS wash 3 times）。

置于37℃、5%CO2培养箱中培养。待细胞密度达到80%-90%既可用于转染。

B）配置DNA混合液：将7.5 ug PAX2 、2.5 ug pMD2和10ug 目的DNA溶于2.5ml Opti-MEM I Reduced Serum Medium 中，用移液器混合均匀。

C）配置脂质体溶液：将60ul lipofenctamine 2000 溶于2.5ml Opi-MEM I Reduced Serum Medum中，用移液器混合均匀,室温下静置5分钟。

D）将上述两种溶液混合，并轻轻混合均匀，室温孵育25分钟。 E）将5ml混合液加入到10cm培养皿，混合均匀。

F）将细胞置于37℃，5%CO2培养箱中培养12-16小时。

G）把细胞传出来到15cm 培养皿，加15ml DMEM, 37℃培养 48-72小时。

H）收集细胞上清液，4℃，1000 rpm 离心5分钟，除去

方法一超速离心沉淀法

1. 取6个Ultra-clear SW28离心管，用70%乙醇消毒后，放在超净工作台中打开紫外灯继续消毒30分钟。

2. 每个Ultra-clear SW28离心管中加入约32ml的预先处理的病毒上清液。

3. 取一支10ml的移液管，吸取12 ml 20%的蔗糖溶液。将移液管一直插入到离心管的底部，缓慢将蔗糖溶液打出4 ml。同样地，将剩下8 ml的蔗糖溶液分别加入到另两个离心管中。另取一支干净的移液管，对剩下3管进行同样处理。

4. 用PBS调整各管的重量，使对应的离心管之间的重量相差不超过0.1g。

5. 按次序将所有6个离心管放入Beckman SW28 超速离心转头中。

6. 4℃，25，000 rpm. (82，700g) 离心2小时。

7. 小心将管子从转头中取出。倒掉上清，将离心管倒扣在纸巾上放置10分钟使剩余的上清流干。吸掉剩余的液滴。在管底应当有可见的沉淀。

8. 每管中加入100ml 不含钙和镁的PBS洗下沉淀。

9. 将SW28超速离心管插入到50ml锥底离心管中，盖上盖子。

10. 在4℃溶解2小时，每隔20分钟轻轻震荡。

11. 4℃，500g离心1分钟，使溶液集中于管

陕西医学杂志 2 0 1 3年 9月第 4 2卷第 9期理等也增加了感染的机会。P a r k等研究发现随着时间延长，颅内感染的几率也相应的增加。为降低术后颅内感染的发生，术后应尽量不留置引流管，由于条件限制必须留置者，应在 2 4￣4 8 h内拔除，超过 1 0 d者可考虑改为内引流，减少留置时间降低感染风险。

1 1 6 7t i v e mu l t i— c e n t e r s t u d y o f 2 9 4 4 p a t i e n t s[ J] . Ne r u o s u r—g e r y, 1 9 9 7, 4 1( 5 ): 1 0 7 3— 1 0 8 1.

1 - 2] 柏鲁宁，张

毅，侯文，等.脑室内出血外引流术后并

发颅内感染的诊治体会[ J] .陕西医学杂志， 2 0 1 1, 4 0 ( 8 ):98 3— 9 8 5.

颅脑损伤患者术后恢复期长，感染多造成致命后果，且患者花费巨大。故术前应充分评估术后感染的风险，给予相应的干预措施，最大限度保护患者的利

[ 3] 黄瑞娟，张征军，魏明.颅内肿瘤切除术后颅内感染危险因素分析[ J] .中国感染控制杂志， 2 0 0 6, 5 ( 4 ): 3 2 5—

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单侧和双侧侧脑室外引流术治疗脑室出血的疗效分析

作者：孟磊 吴长山 郭志强 来源：《中外医学研究》2014年第09期

【摘要】 目的：观察单侧和双侧脑室外引流术治疗脑室出血的临床效果。方法：选取2008年1月-2013年5月笔者所在医院收治的97例脑室出血患者，其中38例采用单侧脑室外引流，59例采用双侧脑室外引流术治疗，两组中分别随机选取30例，对两种不同术式的穿刺引流成功率、引流量、拔管时间、颅内感染率及疗效进行比较。结果：双侧脑室外引流组成功率、引流血性脑脊液量、拔管时间优于单侧脑室外引流组，差异有统计学意义（P 【关键词】 脑室外引流； 脑出血

中图分类号 R651.1 文献标识码 B 文章编号 1674-6805（2014）9-0012-02

脑室出血病情危重，预后差，病死率高，一直为临床医师所研究。脑室出血治疗多以手术为主，其预后与脑室内出血量的多少、原发脑损伤的严重程度、患者年龄的长幼以及有无早期脑室系统扩大等因素均直接影响预后。从2008年1月-2013年5月笔者所在医院收治的97例脑室出血患者中取30例

慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基

础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。 基本概述

慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。

慢病毒的应用

目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi的研究中。由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体, 然后转移到细胞内转录siRNA的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。在所构建的siRNA表达载体中，是由RNA聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA聚

慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基

础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。 基本概述

慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。

慢病毒的应用

目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi的研究中。由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体, 然后转移到细胞内转录siRNA的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。在所构建的siRNA表达载体中，是由RNA聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA聚

陕西医学杂志 2 0 1 3年 9月第 4 2卷第 9期理等也增加了感染的机会。P a r k等研究发现随着时间延长，颅内感染的几率也相应的增加。为降低术后颅内感染的发生，术后应尽量不留置引流管，由于条件限制必须留置者，应在 2 4￣4 8 h内拔除，超过 1 0 d者可考虑改为内引流，减少留置时间降低感染风险。

1 1 6 7t i v e mu l t i— c e n t e r s t u d y o f 2 9 4 4 p a t i e n t s[ J] . Ne r u o s u r—g e r y, 1 9 9 7, 4 1( 5 ): 1 0 7 3— 1 0 8 1.

1 - 2] 柏鲁宁，张

毅，侯文，等.脑室内出血外引流术后并

发颅内感染的诊治体会[ J] .陕西医学杂志， 2 0 1 1, 4 0 ( 8 ):98 3— 9 8 5.

颅脑损伤患者术后恢复期长，感染多造成致命后果，且患者花费巨大。故术前应充分评估术后感染的风险，给予相应的干预措施，最大限度保护患者的利

[ 3] 黄瑞娟，张征军，魏明.颅内肿瘤切除术后颅内感染危险因素分析[ J] .中国感染控制杂志， 2 0 0 6, 5 ( 4 ): 3 2 5—