常用培养基的配制及灭菌技术的实验结论

培养基的配制及灭菌

一． 实验目的

1. 三角瓶，培养皿，试剂瓶，试管，枪尖盒等仪器的清洗。

2. 三角瓶棉塞的制作，三角瓶，吸管，培养皿，试剂瓶，试管，枪尖盒的包装与灭菌。

3. 高温蒸汽灭菌原理的学习。

4. LB和MacConkey培养基的制作与灭菌。

二． 实验原理

1. 高温灭菌的原理：

由于培养基配置过程中并非是无菌操作，所以要通过立即灭菌来防止配制过程中混入的杂菌利用培养基中的营养物质进行繁殖从而破坏培养基的性能。

高压蒸汽灭菌是生物试验应用最广，效果最好的一种湿热灭菌法。在密闭的蒸锅内，其中的蒸汽不能外溢，压力不断上升，使水的沸点不断提高，从而锅内温度也随之增加。在0.1MPa的压力下，锅内温度达121℃。在此蒸汽温度下，可以很快杀死各种细菌及其高度耐热的芽孢。

注意：①使用高压蒸汽灭菌前一定要完全排除锅内空气，使锅内全部是水蒸气，灭菌才能彻底。否则在同一压力下，锅内实际温度和理想温度就会有差距，不能达到最好灭菌效果。②在使用灭菌锅前切勿忘记加水，水加至与三角搁架相平，以防灭菌锅烧干而引起炸裂事故。③使用完后要等到压力降为零再打开锅盖，否则会因为锅内外压力不平衡而导致棉塞蹦出造成污染，也容易伤害到操作者。

2. 培养基的配置原

实验四一、实验目的

培养基的制备与灭菌

1、了解培养基的配制原理，掌握制备培养基的过程。

2.掌握高压蒸汽灭菌及干热灭菌的方法及注意事项

二、实验原理： 培养基是用人工方法，将多种 物质按微生物生长所需而调制成的一种营养基 质，用来分离和培养微生物。培养基可分为天 然培养基、合成培养基和半合成培养基三类。 根据是否含有凝固剂又可分为液体培养基、固 体培养基(1.8-2.0%)、半固体培养基(0.30.5%),

凝固剂一般是琼脂(洋菜),也有用硅胶与明 胶。一般来说，培养基包括有水份、碳源、 氮源、无机盐类以及生长因素等五大类营养 成份。此外还得有适宜的pH值，一定的渗透 压(即浓度)以及氧化还原电位等。 三、实验材料：三角瓶、试管、烧杯、分装 器、玻棒、天平、药匙、pH试纸，搪瓷杯、 量筒、纱布、棉花、橡皮筋、牛皮纸、角匙、 称量纸、各种生化试剂等 。

1、葡萄糖发酵培养基 蛋白胨 10g NaCl 5g 葡萄糖 10g 水1000mL 1.6%溴甲酚 紫水 pH 7.4-7.6 将蛋白胨、NaCl、葡萄糖加入水中，加热调pH至7.4-7.6, 加入1.6%溴甲酚紫水溶液。分装试管内倒置一杜氏小管， 塞上硅胶塞，灭菌。 2、乳糖发酵培养基 蛋白胨 20g

常用培养基的配制

（一）营养琼脂培养基

【用途】供细菌总数测定、保存菌种、细菌纯化、一般细菌培养、血琼脂培养基基础之用。

【成分】牛肉膏 3g

NaCl 5g 蛋白胨 10g 琼 脂 20g

【pH值】7.2±0.2

【制法】上述成分称取38g加蒸馏水1000ml，经121.3℃ 30min高压灭菌备用。 （二）蛋白胨水培养基

【用途】供细菌培养、吲哚试验之用。

【成分】蛋白胨 10g

氯化钠 5g

【pH值】7.6 【制法】将上述成分溶于1000ml蒸馏水中，过滤，分装于试管，每管2～3ml，经121.3℃ 20min高压灭菌备用。

（三）半固体培养基

【用途】供观察细菌动力、菌种保存、H抗原位相变异试验等。 【成分】蛋白胨 10g

氯化钠 5g 琼脂 2.5～3g

【pH值】7.6

【制法】上述成分加入1000ml蒸馏水中，加热溶解，分装于试管，每管3～4ml，经 121.3℃ 20min高压灭菌备用。

（四）营养肉汤培养基

【用途】供一般细菌培养、转种、复苏、增菌等，也可用于消毒效果的测定。 【成

分子实验室常用的培养基配方,和SDS-PAGE缓冲液配方。

五、实验室常用培养基的配制方法

Ampicillin(氨卡青霉素)(100 mg/ml)

组份浓度 100 mg/ml Ampicillin

配制量 50 ml

配制方法 1.称量5 g Ampicillin置于50 ml离心管中。

2.加入40 ml灭菌水，充分混合溶解后，定容至50 ml。

3.用0.22 µm过滤膜过滤除菌。

4.小份分装(1 ml/份)后，-20℃保存。

IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)(24 mg/ml)

组份浓度 24 mg/mL IPTG

配制量 50 mL

配制方法 1.称1.2 g IPTG置于50 ml离心管中。

2.加入40 ml灭菌水，充分混合溶解后，定容至50 ml。

3.用0 22 µm过滤膜过滤除菌。

4小份分装(1 ml，份)后，-20℃保存。

X-Gal (20 mg/ml)

组份浓度 20 mg/ml X-Gal

配制量 50 ml

配制方法 1.称量l g X-Gal置于50 ml离心管中。

2.加入40 ml DMF(二甲基甲酰胺)，充分混合溶解后，定容至50 ml。

3.小份分装(1 ml/份)后，-20℃避光

常用培养基及抗生素配置 1310466559 来源：生物秀知道 浏览次数：1592 网友评论 0 条 LB培养基 将下列组分溶解在0.9L水中： 蛋白胨 酵母提取物 氯化钠 10g 5g 10g 如果需要用1N NaOH（～1ml）调整pH至7.0，再补足水至1L。注：琼脂平板需添加琼脂粉12g/L,上层琼脂平板添加琼脂粉7g/L。 SOB培养基 将下列组分溶解在0.9L水中： 蛋白胨 酵母提取物 氯化钠 1 mol/L 氯化钾 20g 5g 0.5g 2.5ml 用水补足体积到1L。分成100ml的小份，高压灭菌。培养基冷却到室温后，再在每100ml的小份中加1ml灭过菌的1mol/L氯化镁。 SOC培养基 成分、方法同SOB培养基的配制，只是在培养基冷却到室温后，除了在每100ml的小份中加1ml灭过菌的1mol/L氯化镁外，再加2ml灭菌的1mol/L葡萄糖（18g葡萄糖溶于足够水中，再用水补足到100ml，用0.22um的滤膜过滤除菌）。 TB培养基 将下列组分溶解在0.9L水中： 蛋白胨 酵母提取物 甘油 12g 24g 4ml 各组分溶解后高压灭菌。冷却到60℃，再加100ml灭菌的170mmol/L KH2PO4/0.72 m

备注：培养基和激素母液配制方法

（1）母液配制时，先向容量瓶中注入1/3定容体积的蒸馏水，再一一称取各种盐放入烧杯中溶解，装入容量瓶，

不得一次称取所有盐，混合溶解！在配制大量母液时，氯化钙最后加入。

（2）200×Fe盐溶液

称取1.39g FeSO4?7H2O溶于水（A液）；称取1.865 g Na2?EDTA溶于热水（B液）； 将A液缓慢倒入正在加热的B液中，加水接近250ml，煮沸，混合液颜色变深，冷却到室温，定容到250ml后,置于棕色试剂瓶内4℃保存。

（3）0.5mg/ml 2,4-D母液的配法

称取50mg 2,4-D，置于小烧杯内；加少量无水乙醇或95%乙醇使之完全溶解； 加水定容至100ml，4℃保存。如果出现沉淀，需要重新配置。

（4）0.5mg/ml α-NAA母液的配法

称取100mgNAA置于小烧杯内；用1N的KOH溶液溶解NAA； 用水定容至200ml，4℃保存。

（5）0.5mg/ml 6-BA母液的配法

称取100mg 6-BA置于小烧杯中；加少量的浓盐酸，用玻棒研磨成糊状，再加入少

量浓盐酸，使之完全溶解；用水稀释并定容至200ml，4℃保存。

（6）100mM乙酰丁香酮（As）

常用培养基及基本特性

1、RPMI-1640 Medium

RPMI-1640广泛应用于哺乳动物、特殊造血细胞、正常或恶性增生的白细胞，杂交瘤细胞的培养，是目前应用十分广泛的培养基。主要用于悬浮细胞培养。其它像K-562、HL-60、Jurkat、Daudi、IM-9等成淋巴细胞、T细胞淋巴瘤细胞以及HCT-15上皮细胞等均可参考使用。 2、Minimum Essential Medium（MEM）

也称最低必需培养基，它仅含有12种必需氨基酸、谷氨酰胺和8种维生素。成分简单，可广泛适应各种已建成细胞系和不同地方的哺乳动物细胞类型的培养。MEM-Alpha一般用于培养一些难培养细胞类型，而其它没有特殊之处的细胞株则几乎均可采用MEM来培养。

3、DMEM-高糖（标准型）是一种应用十分广泛的培养基，可用于许多哺乳动物细胞培养,更适合高密度悬浮细胞培养。适用于附着性较差，但又不希望它脱离原来生长点的克隆培养，也可用于杂交瘤中骨髓瘤细胞和DNA转染的转化细胞的培养。

4、DMEM-低糖（标准型）是一种应用十分广泛的培养基，可用于许多哺乳动物细胞培养。低糖适于依赖性贴壁细胞培养，特别适用于生长速度快、附着性较差的肿瘤细胞培养。 5、DMEM/F12

实验二 植物组织培养培养基母液的配制

实验二 植物组织培养培养基 植物组织培养培养基 组织培养 母液的配制

实验二 植物组织培养培养基母液的配制

简 介植物在自然状态下生长时，具有完整的营养 体，是属于自养型的，很多营养物质可以 自制，对外界营养条件的要求比较简单， 而在离体条件下生长的植物器官、组织和 整体植物不同，属于异养型，要求的营养 条件十分复杂，因此在人工合成培养基的 组成和制备上必须全面考虑，满足供应。

实验二 植物组织培养培养基母液的配制

一、实验目的 掌握植物组织培养培养基母液的配置过程。 二、实验材料 仪器 冰箱、天平(0.0001g) 容量瓶: 1000 ml, 500 ml、250 ml、100 ml、25 ml 广口储液瓶：500 ml、250 ml、50 ml、25 ml 烧杯：1000 ml 、500 ml 、250 ml、100 ml 、50 ml 数十根玻璃搅棒、大药勺、小药勺 标签纸、胶水

实验二 植物组织培养培养基母液的配制

药品 50 %酒精、95 %酒精、1 mol/L盐酸、1 mol/L NaOH 几种常用的培养基所需的大量元素、微量元 素、有机物、激素、铁盐等药品 蒸馏水

实验二 植物组织培养培养基母液的配制

三、实

常用培养基的制备

技能训练3 常用培养基的制备

常用培养基的制备

实训目标熟悉培养基制备的基本程序 会制备常用的培养基

常用培养基的制备

仪器材料高压蒸气灭菌器、电热干燥箱、电炉、天平、 量筒、漏斗、试管、培养皿、烧杯、三角烧瓶、 营养琼脂培养基(或伊红美兰琼脂培养基、三 糖铁琼脂培养基、SS琼脂培养基、麦康凯琼脂 培养基)等

常用培养基的制备

方法步骤

(一)营养琼脂培养基 (二)血液琼脂培养基 (三)肉汤培养基 (四)半固体培养基

常用培养基的制备

(一)营养琼脂培养基计算 称量 溶化 倒平板或倒试管 灭菌 无菌检验 备用

常用培养基的制备

1.计算：根据营养琼脂培养基的说明书了解营养琼脂粉与水的比 例，一般是1000 ml蒸馏水中应加营养琼脂粉31.3g,再根据 培养基的需要量确定营养琼脂粉的用量。 营养琼脂粉的量=31.3×15×n/1000 (g) 其中： 15代表一个平板需要营养琼脂约15 ml; n代表要做的培养基平板的数量

常用培养基的制备

2.称量：用普通天平准确称量出营养琼脂粉的量，用量筒量出相 应的 蒸馏水的量，要尽量准确。

常用培养基的制备

3.溶化：将营养琼脂粉和蒸馏水倒入搪瓷缸中，于电炉上加热溶 化，边加热边搅拌，沸腾时立即从

大肠杆菌培养

一、菌种冻存液的制备

含有足量细菌的液体培养基离心后在沉淀中加入等量40%甘油，-80oC冻存。 二、培养基制备

LB培养基配方（胰化蛋白胨（Trypton）：10 g/L；酵母提取物（Yeast Extract）：5 g/L；NaCl：10 g/L；pH 7.4）

液体培养基

胰化蛋白胨 10.0g 酵母粉 5.0g 氯化钠 10.0g 水 1000ml pH 7.4

固体培养基在液体培养基的基础上再加入1.5％－2.0％的琼脂 三、平板的制备

1）称取胰化蛋白胨10.0g，酵母粉5.0g，NaCl 10.0g，加入800mL二次水溶解，并用玻璃棒搅拌均匀，用1mol/L的NaOH调pH至7.4左右，定容至1L，调pH 7.4（若溶液pH大于7.4，用1mol/L HCl回调）。

2）分装在锥形瓶中，每瓶量不宜太多，没过瓶底一指左右。如需固体培养基在分装后的液体培养基内加入约2%的琼脂（150mL液体培养基加入2.5g琼脂）。 3）在锥形瓶口依次覆盖带滤纸通气小孔的塑料膜和硬质纸，用皮筋捆好。所有锥形瓶如上述操作。用记号笔注明培养基名称、配制日期。 4）