cat酶活性测定意义

植物组织中过氧化氢酶的活性测定—紫外吸收法

【原理】

H2O2在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。 【仪器与用具】

紫外分光光度计；冷冻离心机；研钵；容量瓶；刻度吸管；恒温水浴；分析天平 【试剂】

1. 0.05mol/L pH7.0磷酸缓冲液

2. 0.2mol/L H2O2溶液：30% H2O2 11.36ml溶于磷酸缓冲液中，定量至250ml。 3.0.05 mol/LTris-Hcl缓冲液（pH7.0） 【材料】

正常生长或经逆境处理的新鲜植物组织 【方法步骤】

1.酶液提取：称取剪碎混匀的植物样品（如叶片等）1.00g置与预冷的研钵中，加入适量预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂冰浴研磨成匀浆后，转入10ml容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到10ml。取提取液5ml于离心管中，在4℃、15000g下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液。4℃下保存备用。

2.CAT活性测定

（1）取10ml具塞试管，加2ml酶提取液于沸水浴中加热煮死，冷却备用。 （2）取10ml具塞试管，3

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抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法

一、超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法）

1、试剂的配制

（1）0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：

A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g；

B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。

分别用蒸馏水定容到1000ml。

0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。加入10gPVP（聚乙烯吡咯烷酮）

参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267～268。

（2）130mmol/L甲硫氨酸溶液：取1.399g Met用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至100ml。网上说定容到100ML我也不懂。拜托

（3）100μmol/L EDTA-Na2溶液：取0.03721g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml；

（4）100μM核黄素溶液：取0.0075g核黄素用蒸馏水定容至100ml，避光保存，随用随配

抗氧化酶（SOD、POD、CAT）活性测定方法

一、 超氧化物歧化酶（SOD）活性测定（氮蓝四唑光化还原法） 1、试剂的配制

（1）0.05mol/L磷酸缓冲液(PBS，pH7.8)：

A母液：0.2mol/L磷酸氢二钠溶液: 取Na2HPO4·12H2O（分子量358.14）71.7g； B母液：0.2mol/L磷酸二氢钠溶液：取NaH2PO4·2H2O（分子量156.01）31.2g。 分别用蒸馏水定容到1000ml。

0.05mol/L PBS（pH7.8）的配制：分别取A母液(Na2HPO4) 228.75ml，B母液(NaH2PO4) 21.25ml，用蒸馏水定容至1000ml。加入10gPVP（聚乙烯吡咯烷酮）

参考文献：李合生主编：植物生理生化实验原理和技术.高等教育出版社，2000：267～268。

（2）130mmol/L甲硫氨酸溶液：取1.399g Met用磷酸缓冲液（pH7.8）定容至100ml。网上说定容到100ML我也不懂。拜托

（3）100μmol/L EDTA-Na2溶液：取0.03721g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000ml； （4）100μM核黄素溶液：取0.0075g核黄素用蒸馏水定容至100m

A液：0.2 mol/L Na2HPO4-12 H2O 71.64g定容至1000ml B液：0.2 mol/L NaH2PO4-2H2O 31.2g定容至1000ml 1、超氧化物歧化酶SOD活性测定

0.05mol/L磷酸缓冲液(pH7.8)取A液228.75ml，B液21.25ml定容至1000mL。 130mmol/L甲硫氨酸(Met)溶液：称取1.9399gMet用磷酸缓冲液定容至100mL

750u mol/L氮蓝四唑溶液：称取0.06133gNBT用磷酸缓冲液定容至100mL，用前配避光 100u mol/L EDTA-Na2溶液：称取0.03721g EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1000mL。用前配置，避光保存。

20u mol/L核黄素溶液：称取0.0753g核黄素用蒸馏水定容至1000ml，用前配置，避光 2、过氧化物酶POD活性测定

愈创木酚、30%过氧化氢、

100m mol/L磷酸缓冲液（pH6.0）：分别取贮备液A：0.2 mol/L Na2HPO4 6.15mL溶液与贮备液B ：0.2 mol/L NaH2PO4溶液43.85mL充分混匀定容至100mL。

20m mol/L KH2PO4：

一、过氧化物酶（POD）活性的测定

POD测定参照李合生等（2003）的愈创木酚法方法进行测定，略加改动。 测定：称取样品0.5g，加入5mL 1／15mol／L PH=7.0的磷酸缓冲溶液，冰浴研磨成匀浆，4℃条件下12000r/min离心15min，上清液为粗酶液。然后在试管中加pH 7.0的磷酸缓冲液2 ml，愈创木酚（0.2%）0.5ml，浓度为0.15%的H2O2 0.5ml，取0.3ml的酶提取液加入到试管中，空白以缓冲液代替。在470nm下测定其吸光度，加入酶液时开始计时，每隔30s读数一次，连续记录5分钟。以每分钟每克鲜重增加0.1的酶量作为一个酶活性单位。

△470 ×VT

POD活性=

0.01×t×Vs×W

式中：△470----反应时间内吸光度值的变化；

VT ----提取酶液的总体积（ml） t----反应的时间（min）

Vs ----测定时取用酶液体积（ml） W----样品鲜重（g）

二、多酚氧化酶（PPO）活性的测定

多酚氧化酶活性测定参照朱广廉等(1990)的方法，略加改动。

酶液制备：称取样品0.5g，加入5mL 0.1mol／L PH=6.0的磷酸缓冲溶液

一、过氧化物酶（POD）活性的测定

POD测定参照李合生等（2003）的愈创木酚法方法进行测定，略加改动。 测定：称取样品0.5g，加入5mL 1／15mol／L PH=7.0的磷酸缓冲溶液，冰浴研磨成匀浆，4℃条件下12000r/min离心15min，上清液为粗酶液。然后在试管中加pH 7.0的磷酸缓冲液2 ml，愈创木酚（0.2%）0.5ml，浓度为0.15%的H2O2 0.5ml，取0.3ml的酶提取液加入到试管中，空白以缓冲液代替。在470nm下测定其吸光度，加入酶液时开始计时，每隔30s读数一次，连续记录5分钟。以每分钟每克鲜重增加0.1的酶量作为一个酶活性单位。

△470 ×VT

POD活性=

0.01×t×Vs×W

式中：△470----反应时间内吸光度值的变化；

VT ----提取酶液的总体积（ml） t----反应的时间（min）

Vs ----测定时取用酶液体积（ml） W----样品鲜重（g）

二、多酚氧化酶（PPO）活性的测定

多酚氧化酶活性测定参照朱广廉等(1990)的方法，略加改动。

酶液制备：称取样品0.5g，加入5mL 0.1mol／L PH=6.0的磷酸缓冲溶液

准确称取天山云杉种子0.1 g，先加入 1 ml 预冷的50 mmol/ L的磷酸缓冲液 (pH 7.0，内含1 mmol/ L EDTA)，研磨成匀浆，然后用 4.5 ml 分两次冲洗研钵至试管中，4 ℃，10000 r/min 离心 20 min，上清液即为酶提取液，4 ℃保存用于ROS系统酶活性分析。 3 酶活性的测定

3.1 过氧化物酶 (POD，EC 1.11.1.7) 活性的测定。

按照 Chance 和 Maehly[6]的方法，并作如下修改:反应混合液为50 mmol/ L的磷酸缓冲液 (pH 7.0，内含 0.1 mmol/ L EDTA) 2.9 mL，2 % H2O2 1.0 mL，50 mmol/ L 愈创木酚1.0 mL。测定时，反应混合液先在 25 ℃ 水浴中预热，立即加入0.1 mL酶液以启动反应，以缓冲液调零，测定OD470值，每隔 30 s读数一次。取 0 — 60 s 时间段，即 1 min 反应时间来计算酶活性。以每分钟OD470增加0.01的酶量为一个酶活单位，U·g-1。

计算公式: POD活性 = ΔA470 × Vt × (0.01× t × FW × V1) -1 注: ΔA470:反应时间内

土壤酶活性测定方法

土壤脲酶的测定方法（苯酚钠—次氯酸钠比色法）

一、原理

脲酶存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。它是一种酰胺酶作用是极为专

性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和二氧化碳、水。土壤脲酶活性与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。

土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。本方法以尿素为基质，根据酶促产物氨与苯酚-次氯酸钠作用生成蓝色的靛酚，来分析脲酶活性。 二、试剂 1）甲苯

2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100ml。

3）PH6.7柠檬酸盐缓冲液：184g柠檬酸和147.5g氢氧化钾（KOH）溶于蒸馏水。将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释定容至1000ml。 4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5g苯酚溶于少量乙醇，加2ml甲醇和18.5ml丙酮，用乙醇稀释至100ml（A液），存于冰箱中；27gNaOH溶于100ml水（B液）。将A、B溶液保存在冰箱中。使用前将A液、B液各20ml混合，用蒸馏水稀释至

土壤酶活性测定方法

土壤脲酶的测定方法（苯酚钠—次氯酸钠比色法）

一、原理

脲酶存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。它是一种酰胺酶作用是极为专

性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和二氧化碳、水。土壤脲酶活性与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。

土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。本方法以尿素为基质，根据酶促产物氨与苯酚-次氯酸钠作用生成蓝色的靛酚，来分析脲酶活性。 二、试剂 1）甲苯

2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100ml。

3）PH6.7柠檬酸盐缓冲液：184g柠檬酸和147.5g氢氧化钾（KOH）溶于蒸馏水。将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释定容至1000ml。 4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5g苯酚溶于少量乙醇，加2ml甲醇和18.5ml丙酮，用乙醇稀释至100ml（A液），存于冰箱中；27gNaOH溶于100ml水（B液）。将A、B溶液保存在冰箱中。使用前将A液、B液各20ml混合，用蒸馏水稀释至

土壤酸性磷酸酶活性的测定

1．试剂配制

(1)0.115M p-硝基苯磷酸钠溶液

取10.67g p-硝基苯磷酸二钠（6H2O,分子量为371.1），溶于pH4.5通用缓冲液中并稀释至250ml.4摄氏度冰箱保存。

(2)通用缓冲液（pH4.5）（缓冲液久置会有沉淀）

原液由以下成分组成:

三羟甲基氨基甲烷12.1g 顺丁烯二酸11.6g 柠檬酸14g 硼酸6.3g

溶于500ml 1N NaOH（40g定容1L）中，加蒸馏水至1L。取原液200 ml，再加入0.1N HCL或浓HCL来调pH为4.5。最后稀释至1L，即得。 (3)甲苯

(4)0.5 mol/L Cacl2.2H2O溶液：

36.75g Cacl2.2H2O定容500ml. (无水CaCl2: 11.1g定容200ml) (5)0.5 mol/L NaOH溶液：20g NaOH定容1L. 2．测定步骤

取1g土壤，置于50ml三角瓶中，加4ml通用缓冲液（pH4.5）、0.25ml甲苯和1ml 0.115M p-硝基苯磷酸钠溶液,摇匀后，置于37℃恒温箱中1h。

培养结束后，加入1ml 0.5 mol/L氯化钙溶液和4ml 0.5 mol/L NaOH溶液，通过