免疫标记技术检测方法

包埋后免疫胶体金标记技术

1. 试剂

固定液：0.1M二钾砷酸鈉缓冲液pH7.4（4%多聚甲醛+0.1%戊二醛+4%蔗糖） 洗涤液：0.1M二钾砷酸鈉缓冲液pH7.4（4%蔗糖）

醛基灭活液：0.1M二钾砷酸鈉缓冲液pH7.4（4%蔗糖+0.1M甘氨酸） 脱水剂：甲醇（ddH2O稀释成30%，50%，70%，80%，90%，95%） 包埋剂：K4M (2.7g交联剂A+17.3单体B+0.1g引发剂C)

标记封闭液：0.01M磷酸盐缓冲液pH7.4(1%BSA+0.05%TritonX-100+0.05%Tween 20) 标记洗涤液：0.01M磷酸盐缓冲液pH7.4

抗体稀释液：0.01M磷酸盐缓冲液pH7.4(1%BSA+0.05%Tween 20)

染色液：醋酸铀（3-4g醋酸双氧铀+100ml50%甲醇）；柠檬酸铅pH12（1.33g硝酸铅+1.76g柠檬酸鈉+30mlddH2O）

2. 主要仪器：镍网（喷有方华膜和碳膜）、镊子、Parafilm、自制小环、冰箱（4℃至-35℃）、紫外聚合箱、培养皿、透射电镜、离子溅射仪、超薄切片机、恒温箱（28℃） 0.2二钾砷酸鈉缓冲液母液pH

DNA分子标记技术

维普资讯

安徽农业科学。 u aoAhi g. c2O, ( ) 42 72 J r lf nuA, Si 073 2: 2— 44 on i . 547

责任编辑

孙红忠

责任校对

李洪

D NA分子标记技术及其应用白玉 (都范学命科学院北 o3首师大生学，京l0) 07摘要对R L、A D A L、S、 S FP R P、FP SR I R等常用的D A分子标记技术以及其他几种新兴的标记技术( N、S等) S N S PE F的原理、特点进行了综

述，认为利用 D A分子标记技术来鉴定品种具有客观、 N准确、快速的特点，可鉴定形态上很难或者根本无法鉴别的品种。分子标记技且术已成为品种鉴定技术领域的主流和发展趋势。

关键词 D A分子标记；n R P; PSR I R品种鉴定 N R;A D;; S; 6 L S S中图分类号 Q 0文献标识码 A 5 3 文章编号 01— 6120)4 042 0 57 61(072— 72— 3

遗传标记 ( eec a e是指可追踪染色体、 G n im r r t k )染色体某一

的遗传信息。⑥D A分子标记技术简单、 N快速、易于自动化。⑦提取的 D A样品， N在适宜条件下可长期保存，这

免疫分析检测技术

原理：

基于抗原、抗体的特异性识别和结核反应的分析方法，通过对抗原或抗体进行标记（酶、荧光物质、放射性同位素标记等），利用标记物的信号放大作用，与现代测试技术相结合，对样品中特定的目标物进行一定的目标物进行定性定量测定。 特点：

1) 特异性强、灵敏度高

2) 方法便捷、分析容量大、检测成本低

3) 可提供系列化的产品以及技术，产品可以商业化。

1. 免疫检测技术按标记抗原或抗体标记物的不同可区分为放射免疫分析法（RIA）、酶免疫分析法（EIA）、荧光免疫分析法（FIA）等，并由这些方法延伸形成了免疫传感器、免疫亲和层析法等。最早残留免疫检测中，RIA占了很大比重，但由于该方法存在放射性防护和废物处理等问题，应用受到较大限制。免疫检测法特别是酶联免疫吸附法（ELISA）按抗原、抗体的特异性结合过程中是否有两种抗体（抗原）同时与一种抗原（抗体）竞争结合的情况，而区分为非竞争性ELISA法和竞争性ELISA法两种类型。一般目标检测物是大分子的常用非竞争性ELISA法，而目标检测物是小分子的则常采用竞争性ELISA法。大部分残留物质分子量小于1000，不具备免疫原性，以此制备的抗体，进行农药残留免疫检测时多用竞争性酶联免疫反应。

免疫分析检测技术

原理：

基于抗原、抗体的特异性识别和结核反应的分析方法，通过对抗原或抗体进行标记（酶、荧光物质、放射性同位素标记等），利用标记物的信号放大作用，与现代测试技术相结合，对样品中特定的目标物进行一定的目标物进行定性定量测定。 特点：

1) 特异性强、灵敏度高

2) 方法便捷、分析容量大、检测成本低

3) 可提供系列化的产品以及技术，产品可以商业化。

1. 免疫检测技术按标记抗原或抗体标记物的不同可区分为放射免疫分析法（RIA）、酶免疫分析法（EIA）、荧光免疫分析法（FIA）等，并由这些方法延伸形成了免疫传感器、免疫亲和层析法等。最早残留免疫检测中，RIA占了很大比重，但由于该方法存在放射性防护和废物处理等问题，应用受到较大限制。免疫检测法特别是酶联免疫吸附法（ELISA）按抗原、抗体的特异性结合过程中是否有两种抗体（抗原）同时与一种抗原（抗体）竞争结合的情况，而区分为非竞争性ELISA法和竞争性ELISA法两种类型。一般目标检测物是大分子的常用非竞争性ELISA法，而目标检测物是小分子的则常采用竞争性ELISA法。大部分残留物质分子量小于1000，不具备免疫原性，以此制备的抗体，进行农药残留免疫检测时多用竞争性酶联免疫反应。

SSR 分子标记技术在玉米育种中的应用

SSR分子标记技术在玉米育种中的应用

王勇,张元昶,方忠 (广西大学农学院,广西南宁530005)

摘要 介绍了SSR分子标记技术的原理、特点、类型及其在玉米遗传图谱的构建、品种纯度鉴定和玉米遗传多样性等育种中的应用。关键词 玉米;SSR;遗传育种

中图分类号 S513.032 文献标识码 A 文章编号 0517-6611(2007)01-00052-03

UtilizationofSSRMarkersinMaizeGeneticBreedingWANGYongetal (AgriculturalCollege,GuangxiUniversity,Nanning,Guangxi530005)Abstract Theprinciple,characteristicsandtypesofSSRmarkerswereintroduced.Inaddition,itsapplicationwasmainlyreviewedinthreeaspectsin-cludingtheconstructionofthegeneticlinkagemap,thedetectionofthepurityofvarietyandth

AFLP分子标记技术及其在水产动物中的应用

第 24 卷 第 7 期2009 年 7 月现 代 渔 业 信 息

MODERN FISHERIES INFORMATIONVol.24 No.7Jul., 2009

AFLP分子标记技术及其在水产动物中的应用

姚红伟 袁霞 付鑫

（大连水产学院生命科学与技术学院）

中国大连市黑石礁街52号 邮编：116023

景娜娜

（山西师范大学）

中国山西省临汾市贡院街1号 邮编：041004

【提要】 AFLP分子标记技术是DNA指纹技术的重大突破，由于其快速、简便、有效，因而在医学、农业、林业、畜牧业、渔业等领域中得到了广泛的应用。近年来人们不断地将这一技术完善和发展，使得AFLP成为迄今为止最有效的分子标记。本文简述了AFLP技术的基本原理、技术流程以及在水产动物中的应用情况。

姚红伟等，2009。AFLP分子标记技术及其在水产动物中的应用，《现代渔业信息》杂志，24（7）：22-24。

关键词：AFLP 水产动物 应用

扩增长度片段多态性（Amplified Fragment Length Polymorphism，AFLP）是1992年由荷兰Keygene公

非标记抗体酶法

由于酶标抗体存在一些缺点，例如①酶与抗体间的共价连结可损害部分抗体和酶的活性；②抗血清中的非特异性抗体被酶标记后，与组织成分结合，可致背景染色等。为此Sternberger等在酶标法的基础上，发展了非标记抗体酶法。包括酶桥法（Enzyme Bridge Method）和过氧化物酶抗过氧化物酶法（Peroxidase Antiperoxidase Method, PAP法）。现分述如下。 （一）酶桥法

1．基本原理 首先用酶免疫动物，制备效价高、特异性强的抗酶抗体，然后使用第二抗体作桥，将抗酶抗体连结在与组织抗原结合的第一抗体上，再将酶结合在抗酶抗体，经呈色显示抗原的分布。在此过程中，任何抗体均未被酶标记，酶是通过免疫学原理与抗酶抗体结合，避免了共价连结对抗体和酶活性的损害，提高方法的敏感性，且能节 省第一抗体的用量。

2．染色步骤 主要程序如图4-4

图4-4 酶桥法主要染色步骤

（1）切片准备及第一抗体孵育前处理同间接法，第一抗体（假设来自种属A）孵育24h（4℃）。第一抗体的稀释度可高些，使抗体的两个Fab段均与组织抗原结合，较牢固，漂洗时不易丢失。

（2）切片与第二抗体（也称桥抗体，抗种属a I

食品的免疫学检测方法

免疫学检测方法是应用免疫学理论设计的一系列测定抗原、抗体、免疫细胞及其分泌的细胞因子的实验方法,其基本原理是抗原抗体反应。抗原抗体反应是指抗原与相应抗体之间所发生的特异性结合反应。随着学科间的相互渗透，免疫学涉及的范围不断扩大，新的免疫学检测方法层出不穷。免疫学方法的应用范围亦在日益扩大，不仅成为多种临床疾病诊断的重要方法，也为众多学科的研究提供了方便。

免疫学检测技术是食品检测技术中的一个重要组成部分，特别是三大免疫技术———荧光免疫技术、酶免疫技术和放射免疫技术在食品检测中得到了广泛应用。利用免疫学检测技术可检测细菌、病毒、真菌、各种毒素、寄生虫等，还可用于蛋白质、激素、其他生理活性物质、药物残留、抗生素等的检测，其检测方法简便、快速、灵敏度高、特异性强，特别是单克隆抗体的发展，使得免疫检测方法特异性更强，结果更准确。

一、 免疫荧光技术

免疫荧光技术是一种将免疫反应的特异性与荧光标记分子的可见性结合起来的方法。在一定条件下，用化学方法将荧光物质 （荧光素）与抗体结合，但不影响抗体与抗原结合的活性，与相应抗原结合后，在荧光显微镜下观察抗原的存在与部位，可定位，亦可用荧光计定量。但荧光标记信号较弱，因而检测灵敏度不是很

免疫荧光技术（检测抗核抗体（ANA）的实验方案）

荧光免疫技术是以荧光物质标记的特异性抗体或抗原作为标准试剂，用于相应抗原或抗体的分析鉴定和定量测定。荧光免疫技术包括荧光抗体染色技术和荧光免疫测定两大类。荧光抗体染色技术是用荧光抗体对细胞、组织切片或其他标本中的抗原或抗体进行鉴定和定位检测，可在荧光显微镜下直接观察结果，称为荧光免疫显微技术，或是应用流式细胞仪进行自动分析检测，称为流式荧光免疫技术。荧光免疫测定主要有时间分辨荧光免疫测定和荧光偏振免疫测定等。本次实验以荧光免疫显微技术检测抗核抗体(ANA)为例进行实习。

抗核抗体(antinuclear antibody，ANA)又称抗核酸抗原抗体，是一组将自身真核细胞的各种成分脱氧核糖核蛋白(DNP)、DNA、可提取的核抗原(ENA)和RNA等作为靶抗原的自身抗体的总称，能与所有动物的细胞核发生反应，主要存在于血清中，也可存在于胸水、关节滑膜液和尿液中。

抗核抗体实验原理

以小鼠肝细胞或某些培养细胞(如Hep-2)作抗原片，将病人血清加到抗原片上。如果血清中含有ANA，就会与细胞核成分特异性结合。加入荧光素标记的抗人IgG抗体又可与ANA结合，在荧光显微镜下可见细胞核部位呈现荧光。

原 位 杂 交

(In situ hybridization)

一、 目的

掌握核酸探针原位杂交操作技术，并利用该技术对单细胞的靶目标进行定位，用于细胞生物学基础研究。

二、 原理

原位杂交技术（in situ hybridization）是分子生物学和组织化学成功结合的产物，是特定标记的已知序列核酸作为探针与细胞或组织切片中核酸进行杂交并对其实行检测的方法。其基本原理是含互补序列的标记DNA或RNA片段，即探针，在适宜的条件下与细胞内特定的DNA或RNA形成稳定的杂交体。

原位杂交能在成分复杂的组织中进行单一细胞的研究而不受同一组织中其它成分的影响，因此对于那些细胞数量少且散在于其他组织中的细胞内DNA或RNA研究更为方便；由于原位杂交不需要从组织中提取核酸，对于组织中含量极低的靶序列有极高的敏感性，并可完整地保持组织与细胞的形态，更能准确地反映出组织细胞的相互关系及功能状态。

三、 仪器设备

烘箱，切片机，展片机，染色缸，湿盒，原位PCR仪，显微镜、镊子、量筒、烧杯、

吸水纸、枪与枪头、载玻片、盖玻片、冰盒等。

四、 材料和试剂

1．材料：带有病原体的水生动物，如感染WSSV病毒的对虾、感染虹彩病毒的水生动物等。 2．试剂：

Da