测序后blast结果分析

测序常见峰图及原因说明

1.PCR产物电泳检测条带单一，为什么测序结果说模板杂？ 2. 什么是碱基缺失？ 3. 什么是引物不纯？

4. 重复结构对测序有哪些影响？ 5. 什么是模板不单一？

6. Poly结构的测序结果是怎样的？

7. 含有回文结构的模板测序结果是怎样的？ 8. 测序峰图为前双峰的结果是什么样的？ 9. 测序峰图为后双峰是什么样的？

10. 无信号的结果：信号值(ATGC的平均值)皆小于100

11. 飘峰：这是由于用3.0特殊试剂盒时碱基产生替代而出现碱基位移 12. 没有任何干扰的结果

Q-1.PCR产物电泳检测条带单一，为什么测序结果说模板杂？ 返回顶端 A-1.PCR产物电泳检测的结果只是一个粗略的定性结果。对于与目的片段条带大 小只相差几个碱基的非特异性PCR扩增产物是无法用肉眼区分开的。但是DNA测序反应敏感而客观，可以直接反应出模板本身的情况。需要强调的是，高质量的 PCR产物才可能得到高质量的测序结果，如果您对PCR产物的纯度不很确定，希望您可以将PCR产物进行克隆处理，以确保得到好的测序结果。以下图为例： 该反应的背景信号较高，不利于碱基的判读。 查看大图

解决办法：改变PCR条件，重新扩增。或者可以将该

轻松学用生物软件(1)学用BLAST程序进行数据分析

主要内容

1.基本概念

2.常用BLAST程序介绍 3. BLAST算法简介 4. BLAST常用参数设置 5.本地BLAST的安装步骤 6.本地BLAST的使用 1、基本概念

相似性(Similarity)

是指序列比对过程中用来描述检测序列和目标序列之间相同或相似碱基或氨基酸残基占全部比对碱基或氨基酸残基的比例的高低，属于量的判断。

同源性(Homology)

是指从某一共同祖先经趋异进化而形成的不同序列。只有当两个蛋白质在进化关系上具有共同的祖先时，才可称它们为同源的，属于质的判断。

相似性和同源性的关系

当相似程度高于50%时，比较容易推测检测序列和目标序列可能是同源序列；

而当相似性程度低于20%时，就难以确定或者根本无法确定其是否具有同源性。

总之不能把相似性和同源性混为一谈。所谓“具有50%同源性”，或“这些序列高度同源”等说法，都是不确切的，应避免使用。

序列相似性比较和同源性分析

序列相似性分析：就是用来计算待研究序列与某序列之间的相似性程度，常用的软件包有BLAST、FASTA等；

序列同源性分析：是将待研究与来自不同物

人类基因组计划

一、HGP：人类基因组计划(Human Genome Project) 二、基因组测序 三、基因组分析

四、其他基因组的测序与分析

人的基因这么少，却能行使复杂的功能的原因： 1. 一个基因对应多个产物：可变剪切和蛋白修饰 2. 垃圾基因的功能：非蛋白编码基因的重要功能

任务与进展

完成四张图：遗传图谱、物理图谱、转录图谱、序列图谱

(一) 遗传图谱（Genetic map） 1. 定义

又称连锁图谱（linkage map)或遗传连锁图谱(genetic linkage map) ，是指人类基因组内基因以及专一的多态性DNA标记(marker)相对位置的图谱，其研究经历了从经典的遗传图谱到现代遗传图谱的过程。

2. 经典的遗传图谱（以基因表型为标记） 3. 现代遗传图谱（以DNA为标记）

多态性（polymorphism）：人的DNA序列上平均每几百个碱基会出现一些变异（variation），并按照孟德尔遗传规律由亲代传给子代，从而在不同个体间表现出不同，因而被称为多态性。

? 第一代多态性标记：限制性片段长度多态性-RFLP

? 第二代多态性标记：短的串联重复序列：小卫星DNA、微卫星DNA ? 第

测序常见问题及其分析 Collected by RobertoRun,12.10.2008

(From: http://biology.aweb.com.cn/news/2007/9/5/14270898.shtml)

HTUTU

UUTTH

1、PCR产物测序时出现重叠峰

问题图1（模板中有碱基缺失，往往是单一位点（1-1）或两个位点（1-2）碱基缺失导致测序结果移码）

图1-1

图1-2

解决方法：将PCR产物克隆到质粒（如T载体）中挑单克隆测序，或将PCR产物进行PAGE纯化（至少琼脂糖充分电泳后切胶纯化）后再进行测序。

问题图2（PCR产物不纯，含部分序列一致的两种以上的片段，长度不一）

图2

解决方法：主要原因是PCR产物没有纯化，含有部分序列一致的两种以上长度不一的片段，将PCR产物进行PAGE纯化（至少琼脂糖充分电泳后切胶纯化）后再进行测序，便可解决。

问题图3（测序引物有碱基缺失）

测序引物有碱基缺失（一般是引物的5'端缺失），和模板的碱基缺失即图1有些类似，所不同的是模板碱基缺失一般是在一段正常测序序列后才出现移码，而引物碱基缺失的话，则从测序一开始就出现移码，表面在图形上便是一开始就是严重的

测序常见问题及其分析 Collected by RobertoRun,12.10.2008

(From: http://biology.aweb.com.cn/news/2007/9/5/14270898.shtml)

HTUTU

UUTTH

1、PCR产物测序时出现重叠峰

问题图1（模板中有碱基缺失，往往是单一位点（1-1）或两个位点（1-2）碱基缺失导致测序结果移码）

图1-1

图1-2

解决方法：将PCR产物克隆到质粒（如T载体）中挑单克隆测序，或将PCR产物进行PAGE纯化（至少琼脂糖充分电泳后切胶纯化）后再进行测序。

问题图2（PCR产物不纯，含部分序列一致的两种以上的片段，长度不一）

图2

解决方法：主要原因是PCR产物没有纯化，含有部分序列一致的两种以上长度不一的片段，将PCR产物进行PAGE纯化（至少琼脂糖充分电泳后切胶纯化）后再进行测序，便可解决。

问题图3（测序引物有碱基缺失）

测序引物有碱基缺失（一般是引物的5'端缺失），和模板的碱基缺失即图1有些类似，所不同的是模板碱基缺失一般是在一段正常测序序列后才出现移码，而引物碱基缺失的话，则从测序一开始就出现移码，表面在图形上便是一开始就是严重的

实验三 利用BLAST的数据库比对分析

2012454116郑俊昌

一、实验目的

1、学习BLAST序列相似性网络核酸蛋白数据库比对方法 2、进行网络核酸蛋白数据库基因相似性分析 二、实验内容 1、BLAST工具介绍

BLAST? (Basic Local Alignment Search Tool)工具是用查询的DNA或蛋白质序列与所以可能的序列数据库进行相似性搜索的多个程序。BLAST程序运行速度快，打分合理，容易辨认出真正的匹配与随机背景的不同。BLAST不仅可以进行局部亦可以进行全局搜索，易于发现一些分隔的相似区段。 BLAST的功能：

BLAST对一条或多条序列(可以是任何形式的序列)在一个或多个核酸或蛋白序列库中进行比对。BLAST还能发现具有缺口的比对上的序列。

BLAST可处理任何数量的序列, 包括蛋白序列和核算序列; 也可选择多个数据库但数据库必须是同一类型的, 即要么都是蛋白数据库要么都是核酸数据库。下面介绍5个BLAST分析的程序：

（1） BLASTP是蛋白序列到蛋白库中的一种查询。库中存在的每条已知序列将逐一地同每条所查序列作一对一的序列比对。

（2） BLASTX是核酸序列到蛋白库中的一种查询。先将核酸序列翻译成蛋

PKPM电算结果分析

二 振型曲线的评定

结构基本自振周期的计算方法有三种：能量法，等效质量法，顶点位移法。但是有钢筋混凝土框架的经验公式值：第一振型T1=(0.12-0.15)n，第二振型T2=(1/3-1/5) T1，第三振型T3=(1/5-1/7) T1。详见《高层建筑混凝土结构技术规程》4.2.3，调入PKPM电算结果： 考虑扭转耦联时的振动周期(秒)、X,Y 方向的平动系数、扭转系数

振型号 周 期 转 角 平动系数 (X+Y) 扭转系数 1 0.6323 92.50 0.88 ( 0.00+0.87 ) 0.12 2 0.6194 29.58 0.41 ( 0.31+0.10 ) 0.59 3 0.6159 168.83 0.72 ( 0.69+0.03 ) 0.28 4 0.2030 93.38 0.87 ( 0.00+0.87 ) 0.13 5

PKPM电算结果分析

二 振型曲线的评定

结构基本自振周期的计算方法有三种：能量法，等效质量法，顶点位移法。但是有钢筋混凝土框架的经验公式值：第一振型T1=(0.12-0.15)n，第二振型T2=(1/3-1/5) T1，第三振型T3=(1/5-1/7) T1。详见《高层建筑混凝土结构技术规程》4.2.3，调入PKPM电算结果： 考虑扭转耦联时的振动周期(秒)、X,Y 方向的平动系数、扭转系数

振型号 周 期 转 角 平动系数 (X+Y) 扭转系数 1 0.6323 92.50 0.88 ( 0.00+0.87 ) 0.12 2 0.6194 29.58 0.41 ( 0.31+0.10 ) 0.59 3 0.6159 168.83 0.72 ( 0.69+0.03 ) 0.28 4 0.2030 93.38 0.87 ( 0.00+0.87 ) 0.13 5

PKPM电算结果分析

二 振型曲线的评定

结构基本自振周期的计算方法有三种：能量法，等效质量法，顶点位移法。但是有钢筋混凝土框架的经验公式值：第一振型T1=(0.12-0.15)n，第二振型T2=(1/3-1/5) T1，第三振型T3=(1/5-1/7) T1。详见《高层建筑混凝土结构技术规程》4.2.3，调入PKPM电算结果： 考虑扭转耦联时的振动周期(秒)、X,Y 方向的平动系数、扭转系数

振型号 周 期 转 角 平动系数 (X+Y) 扭转系数 1 0.6323 92.50 0.88 ( 0.00+0.87 ) 0.12 2 0.6194 29.58 0.41 ( 0.31+0.10 ) 0.59 3 0.6159 168.83 0.72 ( 0.69+0.03 ) 0.28 4 0.2030 93.38 0.87 ( 0.00+0.87 ) 0.13 5

转录组分析

研究背景：

RNA-Seq是通过结合实验和计算方法来鉴定生物样品中RNA序列的种类和丰度的一种技术。通过RNA-seq，我们就能够确定单链RNA分子中ATCG的顺序。整个过程主要包括：从细胞或组织中提取RNA分子、文库的构建以及后继的生物信息学数据分析。RNA-Seq技术具有许多早期研究方法（如：微阵列）所不具备的优点，如：RNA-Seq平台的高通量、新技术所带来的高灵敏度、发现新转录本、新基因模型以及非编码RNA的能力等。

RNA-Seq技术的到来，使人们认识到，无论是单细胞模式生物还是人类，我们对其转录组的认知异常匮乏。而RNA-Seq产生的新的数据，则可以帮助我们发现基因结构上的巨大差异、鉴定出新的转录本以及能够对small non-coding RNA和lncRNAs有着更好的了解。而且随着测序花费的降低，RNA-Seq的优势体现的更加明显。

服务流程：

样品选取

利用Oligo-dT富集mRNA

mRNA片段化

cDNA合成

末端修复、加polyA、加接头，PCR扩增

数据分析

测序方案：

内容：TotalRNA检测，普通转录组文库构建及测序及信息分析。 测序方式：H