土壤磷酸酶活性测定

4.磷酸酶测定(磷酸苯二钠比色法)： 1、试剂配制 （1）甲苯

（2）磷酸笨二钠：称取6.75g磷酸笨二钠（C6H5PO4Na2.2H2O）溶于水，并稀释至1L（1毫升含25mg酚） （3）缓冲液

（4）pＨ9.0硼酸盐缓冲液： 硼酸盐缓冲液（pH9.0）

A：0.05M硼砂溶液：19.07g硼砂（Na2B4O710H2O）溶于1000mL蒸馏水中 B：0.2M硼酸溶液：12.37g硼酸（H3BO3）溶于1000mL蒸馏水中 硼酸盐缓冲液（pH9.0）：80mLA+20mLB混匀即得

缓冲溶液配制：

(1)酸性磷酸酶:醋酸盐缓冲液(pH=5.0)

A：0.2M醋酸钠溶液：16.4g 无水醋酸钠（C2H3O2Na）溶于1000mL蒸馏水中，或是27.2g三水醋酸钠（C2H3O2Na.3H2O）溶于1000mL水中。 B：0.2M醋酸溶液：11.55mL醋酸定容于1000mL 醋酸盐缓冲液(pH=5.0)：7mLA＋3mLB混合即得 （2）碱性磷酸酶：硼酸盐缓冲液（pH10.0） 硼砂－氢氧化钠缓冲液（pH10.0）：

A：硼砂液：19.072g硼砂溶于1000mL蒸馏水中

B：氢氧化钠溶液：4g氢氧化钠溶于1000mL蒸馏水中

50mLA＋4

土壤酶活性测定方法

土壤脲酶的测定方法（苯酚钠—次氯酸钠比色法）

一、原理

脲酶存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。它是一种酰胺酶作用是极为专

性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和二氧化碳、水。土壤脲酶活性与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。

土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。本方法以尿素为基质，根据酶促产物氨与苯酚-次氯酸钠作用生成蓝色的靛酚，来分析脲酶活性。 二、试剂 1）甲苯

2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100ml。

3）PH6.7柠檬酸盐缓冲液：184g柠檬酸和147.5g氢氧化钾（KOH）溶于蒸馏水。将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释定容至1000ml。 4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5g苯酚溶于少量乙醇，加2ml甲醇和18.5ml丙酮，用乙醇稀释至100ml（A液），存于冰箱中；27gNaOH溶于100ml水（B液）。将A、B溶液保存在冰箱中。使用前将A液、B液各20ml混合，用蒸馏水稀释至

土壤酸性磷酸酶活性的测定

1．试剂配制

(1)0.115M p-硝基苯磷酸钠溶液

取10.67g p-硝基苯磷酸二钠（6H2O,分子量为371.1），溶于pH4.5通用缓冲液中并稀释至250ml.4摄氏度冰箱保存。

(2)通用缓冲液（pH4.5）（缓冲液久置会有沉淀）

原液由以下成分组成:

三羟甲基氨基甲烷12.1g 顺丁烯二酸11.6g 柠檬酸14g 硼酸6.3g

溶于500ml 1N NaOH（40g定容1L）中，加蒸馏水至1L。取原液200 ml，再加入0.1N HCL或浓HCL来调pH为4.5。最后稀释至1L，即得。 (3)甲苯

(4)0.5 mol/L Cacl2.2H2O溶液：

36.75g Cacl2.2H2O定容500ml. (无水CaCl2: 11.1g定容200ml) (5)0.5 mol/L NaOH溶液：20g NaOH定容1L. 2．测定步骤

取1g土壤，置于50ml三角瓶中，加4ml通用缓冲液（pH4.5）、0.25ml甲苯和1ml 0.115M p-硝基苯磷酸钠溶液,摇匀后，置于37℃恒温箱中1h。

培养结束后，加入1ml 0.5 mol/L氯化钙溶液和4ml 0.5 mol/L NaOH溶液，通过

土壤酶活性测定方法

土壤脲酶的测定方法（苯酚钠—次氯酸钠比色法）

一、原理

脲酶存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。它是一种酰胺酶作用是极为专

性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和二氧化碳、水。土壤脲酶活性与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。

土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。本方法以尿素为基质，根据酶促产物氨与苯酚-次氯酸钠作用生成蓝色的靛酚，来分析脲酶活性。 二、试剂 1）甲苯

2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100ml。

3）PH6.7柠檬酸盐缓冲液：184g柠檬酸和147.5g氢氧化钾（KOH）溶于蒸馏水。将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释定容至1000ml。 4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5g苯酚溶于少量乙醇，加2ml甲醇和18.5ml丙酮，用乙醇稀释至100ml（A液），存于冰箱中；27gNaOH溶于100ml水（B液）。将A、B溶液保存在冰箱中。使用前将A液、B液各20ml混合，用蒸馏水稀释至

土壤酸性磷酸酶活性的测定

1．试剂配制

(1)0.115M p-硝基苯磷酸钠溶液

取10.67g p-硝基苯磷酸二钠（6H2O,分子量为371.1），溶于pH4.5通用缓冲液中并稀释至250ml.4摄氏度冰箱保存。

(2)通用缓冲液（pH4.5）（缓冲液久置会有沉淀）

原液由以下成分组成:

三羟甲基氨基甲烷12.1g 顺丁烯二酸11.6g 柠檬酸14g 硼酸6.3g

溶于500ml 1N NaOH（40g定容1L）中，加蒸馏水至1L。取原液200 ml，再加入0.1N HCL或浓HCL来调pH为4.5。最后稀释至1L，即得。 (3)甲苯

(4)0.5 mol/L Cacl2.2H2O溶液：

36.75g Cacl2.2H2O定容500ml. (无水CaCl2: 11.1g定容200ml) (5)0.5 mol/L NaOH溶液：20g NaOH定容1L. 2．测定步骤

取1g土壤，置于50ml三角瓶中，加4ml通用缓冲液（pH4.5）、0.25ml甲苯和1ml 0.115M p-硝基苯磷酸钠溶液,摇匀后，置于37℃恒温箱中1h。

培养结束后，加入1ml 0.5 mol/L氯化钙溶液和4ml 0.5 mol/L NaOH溶液，通过

土壤酶的测定

1． 三角瓶用稀HNO3（3-5%）或用洗衣粉浸泡24h，后刷洗，然后再用蒸馏水润洗，晾干。 2． 土样研磨精细后分袋装好。土量需2g+2.5g+5g+5g=14.5g ，重复一次，14.5×2=29g。

一、过氧化氢酶（容量法）（关松荫P323）

1．试剂配制：

(1)0.3%过氧化氢溶液：

①（1：100 30%的H2O2和水） ②（0.5molH2O2+49.5ml蒸馏水） ③（1ml30% H2O2+99ml蒸馏水） (2)3N硫酸：（10ml硫酸+50ml水） (3)0.1N高锰酸钾溶液 ：（1.58gKMnO4+100ml蒸馏水）

2．操作步骤：

2g风干土置100三角烧瓶→注入40ml蒸馏水和5ml 0.3%过氧化氢（现配）→在往复式振荡机上振荡20min→加入5ml3N硫酸（以稳定未分解的H2O2）→用慢速型滤纸过滤，→吸取25ml滤液，用0.1N高锰酸钾的滴定至淡粉红色

3．结果计算

过氧化氢酶的活性（M），以20min后1g土壤的0.1N KMnO4的毫升数表示： M=（A－B）×T 式中：

A：空白消耗的0.1N KMnO4 毫升数

B：滤液消耗的0.1 N KMnO4 毫升数 T：KMnO4

酸性磷酸酶Km及Vmax值测定 酸性磷酸酶Km及Vmax值测定 Km 清洗试管24支 清洗试管24支 24

一、概述 酸性磷酸酶： 酸性磷酸酶：催化磷酸单酯的水解反应 存在于人的肝脏， 存在于人的肝脏，前列腺等处 植物中以发芽的种子中含量最为丰富。 植物中以发芽的种子中含量最为丰富。

是生物体中重要的一种酶类， 是生物体中重要的一种酶类，为某些疾病的检测 指标。 指标。

二、实验原理酶液 磷酸苯二钠 苯酚 + 磷酸氢二钠

folin-酚测定酚的浓度 酚测定酚的浓度计算出反应速度(用产物生成量/min来表示) 计算出反应速度(用产物生成量 来表示) 来表示

根据双倒数法计算出Km及Vmax 及 根据双倒数法计算出

V=

Vmax [S] Km + [S]

三、实验步骤： 实验步骤：

1、豆芽中的酸性磷酸酶的粗提取 2、制作酶反应时间与产物生成量的关系曲线 3、制作酚标准曲线 [S]与 4、[S]与V0关系实验 双倒数作图法计算Vmax Vmax和 5、双倒数作图法计算Vmax和Km

blank

buffer substrate enzyme Color developed Certain Time Stop the reaction

生化实验课老

钙调磷酸酶抑制剂

（一）器官移植排斥反应

1、移植排斥反应

人体的免疫系统对各种致病因子有着非常完善的防御机制，能够对细菌、病毒、异物、异体组织、人造材料等“异己成分”进行攻击、破坏、清除，这种复杂的免疫学反应是人体非常重要的一种保护机制。受者进行同种异体组织或器官移植后，外来的组织或器官等移植物作为一种“异己成分”被受者免疫系统识别，后者发起针对移植物的攻击、破坏和清除，这种免疫学反应就是移植排斥反应（transplant rejection）。移植排斥反应是影响移植物存活的主要因素之一。

移植排斥反应是非常复杂的免疫学现象，涉及细胞和抗体介导的多种免疫损伤机制，发生原因主要是受体和移植物的人类白细胞抗原HLA（human leucocyte antigen）不同。因此，供者与受者HLA的差异程度决定了排异反应的轻或重。除同卵双生外，二个个体具有完全相同的HLA 系统的组织配型几乎是不存在的，因此在供受者进行配型时，选择HLA配型尽可能地接近的供者，是减少异体组织、器官移植后移植排斥反应的关键

2、发病机制

排斥反应的发生机制主要包括细胞免疫和体液免疫两个方面。临床最常见的急性排斥反应主要由细胞免疫介导，而超急性排斥反应和慢性排斥反应主要由

土壤酶活性测定方法

土壤脲酶的测定方法（苯酚钠—次氯酸钠比色法）

一、原理

脲酶存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。它是一种酰胺酶作用是极为专

性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和二氧化碳、水。土壤脲酶活性与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。

土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。本方法以尿素为基质，根据酶促产物氨与苯酚-次氯酸钠作用生成蓝色的靛酚，来分析脲酶活性。 二、试剂 1）甲苯

2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100ml。

3）PH6.7柠檬酸盐缓冲液：184g柠檬酸和147.5g氢氧化钾（KOH）溶于蒸馏水。将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释定容至1000ml。 4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5g苯酚溶于少量乙醇，加2ml甲醇和18.5ml丙酮，用乙醇稀释至100ml（A液），存于冰箱中；27gNaOH溶于100ml水（B液）。将A、B溶液保存在冰箱中。使用前将A液、B液各20ml混合，用蒸馏水稀释至

植物组织中过氧化氢酶的活性测定—紫外吸收法

【原理】

H2O2在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。 【仪器与用具】

紫外分光光度计；冷冻离心机；研钵；容量瓶；刻度吸管；恒温水浴；分析天平 【试剂】

1. 0.05mol/L pH7.0磷酸缓冲液

2. 0.2mol/L H2O2溶液：30% H2O2 11.36ml溶于磷酸缓冲液中，定量至250ml。 3.0.05 mol/LTris-Hcl缓冲液（pH7.0） 【材料】

正常生长或经逆境处理的新鲜植物组织 【方法步骤】

1.酶液提取：称取剪碎混匀的植物样品（如叶片等）1.00g置与预冷的研钵中，加入适量预冷的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂冰浴研磨成匀浆后，转入10ml容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到10ml。取提取液5ml于离心管中，在4℃、15000g下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液。4℃下保存备用。

2.CAT活性测定

（1）取10ml具塞试管，加2ml酶提取液于沸水浴中加热煮死，冷却备用。 （2）取10ml具塞试管，3