质粒转染实验

质粒转染大肠杆菌

材料试剂：胰化蛋白胨，酵母提取物，琼脂，NaCl，NaOH（调pH），

氨苄青霉素，卡那霉素，质粒提取试剂盒

仪器：高压灭菌锅，42℃恒温水浴锅，，恒温摇床（37℃,225rpm），

无菌培养板，消毒1.5ml离心管，消毒枪头，无菌操作台

实验步骤：

1. LB培养基的配制：

在950 ml去离子水中加入: 胰化蛋白胨 10g 酵母提取物 5g NaCl 10g 摇动容器直至溶质溶解.用5mol/LNaOH调pH至7.0.用去离子水定容至1L.在15psi高压下蒸汽灭菌20min. 固态培养基

LB固体培养基及倒板 ：

（1）.配制：100mlLB培养基加入1.5g琼脂粉

（2）.抗生素的加入：高压灭菌后，将融化的LB固体培养基置与55℃的水浴中，待培养基温度降到55℃时（手可触摸）加入氨苄抗生素（终浓度为50μg/ml），以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。

（3）.倒板：一般10ml倒1个板子。培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照10-15分钟。

（4）.保存：用封口胶封边，并倒置放于4℃保存，一个月内使用。 2. 从-70℃冰箱中取200μl感受态细胞悬液，室温下使

转染实验方案

1. LB培养基的配制：500ml（5皿+2锥形瓶）

准备：500ml玻璃瓶1个，250ml玻璃瓶2个，500ml容量瓶一个，平皿5个 称取：酵母浸提液 5.0g 蛋白胨 10.0g 氯化钠 10.0g 实验操作：

混合后加去离子水（或注射用水）水400ml，待充分溶解后加水定容至500ml，取100ml做固体培养基用装入A瓶，余下装入500ml B瓶中（400ml/瓶） 称取1.5g琼脂粉加入A瓶中

另取一瓶（C瓶）接100ml水（稀释氨苄西林用） 将以上3瓶高压灭菌：121°C , 30min 取氨苄西林一支：规格：1g/支

加水于安瓶中溶解后，移入C瓶中，浓度：10mg/ml 按照50μg/ml氨苄西林的浓度加到A B C三瓶中

A瓶：0.5ml（即为LB固体培养基）——松弛型100μg/ml,严紧型50μg/ml B瓶：2ml（即为LB液体培养基）

将A瓶按20ml/平皿，分别移到5个平皿中，待冷却后即为固体培养基。 用膜封口放入4℃保存。

2. 感受态转化与培养（TOP10）

准备：37℃摇床，37℃烘箱，10cm培养皿（LB琼脂凝胶+氨苄=50 ml LB+0.75 g琼脂+50μl氨苄），冰盒，

1. 菌液OD值越高，质粒产量越高

2. 大肠杆菌OD值越高，提取的质粒的浓度就越高吗？？？还要看质粒纯度，纯度一般

在1.8-1.9最适合，再高了就是蛋白污染

3. 一般而言gene 导入原核细胞称转化，导入真核细胞称转染。

4. 用QIANGEN质粒提取试剂盒提取质粒，我没有提不出来的经历，有以下几点要注意，

从细胞、试剂盒及操作三个方面考虑：

1..确定细菌是阳性转化子，应该含有你的质粒，过夜摇菌已足够，记得加抗生素。 2.关于试剂。溶液2中是否浑浊，SDS在低温产生结晶，使用前用37度水浴。溶液3中的醋酸钾可能产生结晶，使用前应该温水溶解。确认洗脱液1中的乙醇没有挥发，闻一闻就知道了。洗脱液2是否在使用前已加乙醇，加乙醇后在盖子上打钩，以免与没加的混淆。

3.抽提过程中，加溶液1（放4度保存）后应该充分悬浮菌体，以便裂解充分；加溶液2和3应该快，加溶液2后打开盖有丝状物，加溶液3出现絮状沉淀，离心要充分。请严格按说明书操作。

如果你觉得以上几点你都做的很好，试剂盒是新的，换含其它质粒的菌株试一试，如pUC18的转化子。如果试剂和是用过的，放置太久，换其它试剂盒吧，要不换土法试试！

5. Qiagen我卖这么多个，到目前还是零投诉。不过出现

转染细胞的稳定筛选 1、药物筛选前的准备

药筛前应确定药物筛选浓度，不同细胞系具有不同的药物敏感度，因此在筛选前应该用在药物浓度范围内设定浓度梯度来确定筛选稳定克隆的药物浓度。药物浓度一般确定为能使未转染细胞在7天之内全部死亡，如G418一般需要7天，而puro一般时间很短，只需要3-4天即可。 2、药物筛选注意事项 （1）药筛的时间

加药时间一般为转染后48h。但由于慢病毒表达较慢，因此利用慢病毒感染将质粒转入细胞的方法，加药时间一般为72h 空白对照

加药筛选时，最好设置空白对照，即未转染细胞同时加药，待空白对照中细胞全部死亡，转染组中不具有抗药性的细胞基本药杀完，但还需继续加药。 （2）换液

如果加药后，细胞死亡较多，需及时换液，以防死细胞释放有害物质导致具有抗药性的细胞死亡。另外，随着细胞的代谢，抗生素的活性会降低，因此，每隔3-5天应更换一次抗生素筛选培养液。 3、克隆筛选注意事项

若转染的质粒带有荧光标记，不管是以下哪种筛选克隆的方法，都应该选择带有荧光较强的细胞克隆，因为加药筛选时，可能会产生耐药性的细胞，因此最好选择带有荧光较强的细胞。若是转染的质粒不带有荧光，那么只能盲挑。不管是带有或者不带有荧光标记，都应该挑出克隆

实验一 质粒DNA的微量制备（4学时）

实验目的

(1) 了解质粒的特性及其在分子生物学研究中的作用。 (2) 掌握碱裂解法分离、纯化质粒DNA的方法。

实验原理

质粒（Plasmid）是一种双链的共价闭环状的DNA分子，它是染色体外能够稳定遗传的因子。质粒具有复制和控制机构，能够在细胞质中独立自主的进行自身复制，并使子代细胞保持它们恒定的拷贝数。目前，质粒已广泛的用作基因工程中目的基因地运载工具—载体。从大肠杆菌中提取质粒DNA，是一种分子生物学最基本的方法。

质粒DNA分离纯化方法有多种，但其原理和步骤都大同小异。本实验着重介绍碱裂解法制备微量DNA。

在EDTA存在的条件下，用溶菌酶破坏细菌细胞壁，同时经过NaOH和阴离子去污剂SDS处理，使细胞膜崩解，从而达到菌体充分的裂解。此时，细菌染色体DNA缠绕附着在细胞膜碎片上，离心时易被沉淀出来。而质粒DNA则留在上清液内，其中还含有可溶性蛋白质、核糖核蛋白和少量染色体DNA，实验中加入蛋白质水解酶和核糖核酸酶，可以使它们分解，通过碱性酚（pH8.0）和氯仿－异戊醇混合液的抽提可以除去蛋白质。异戊醇的作用是降低表面张力，可以减少抽提过程中产生的泡沫，并能使离心后水层、变性蛋白层和有

1 分子实验报告 2013030020华天瑞

Preparation of Plasmid DNA, Restriction Enzyme Digestion, and

Agarose Gel Electrophoresis

2014/10/14-21

1 Intro

1.1 Objective

To learn

? The characteristics of plasmid DNA

? The method of plasmid DNA mini-preparation by alkaline lysis and the measurement of

DNA concentration by spectrophotometer ? The characteristics of restriction endonuclease

? How to use agarose gel electrophoresis to separate DNAs To understand: The principles of pu

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质粒图谱列表(转贴) (2007-11-19 20:32:55)转载▼ 分类： 核酸技术

登记号--质粒--来源--用途--图谱提供者 0001--pIRES --BD Co--真核表达--yshu3507 0002--pECFP-C1--BD Co--真核表达--yshu3507 0003--pShuttle--/--/--victoh 0004--pSBR322--/--/--chujun_hust

0005--pcDNA3.1(+)/CAT--invitrogen--真核表达--wangjun2002274 0006--pQEx--Qiagen--原核表达--wangjun2002274 0007--pIVEX2.3--Roche--体外转录翻译--wangjun2002274 0008--pIRES-EGFP--/--/--luoqingli2003

0009--pET-28a（+）--Novagen--原核表达--wangjun2002274 0010--pSUPER Vector--oligoengine--siRNA--zyh961171 0011--pET-32a(+)--novagen--原核表达--Crazyvirus

慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基

础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。 基本概述

慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。

慢病毒的应用

目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi的研究中。由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体, 然后转移到细胞内转录siRNA的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。在所构建的siRNA表达载体中，是由RNA聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA聚

慢病毒（Lentivirus）载体是以HIV-1（人类免疫缺陷I型病毒）为基

础发展起来的基因治疗载体。区别一般的逆转录病毒载体，它对分裂细胞和非分裂细胞均具有感染能力。 基本概述

慢病毒载体的研究发展得很快，研究的也非常深入。该载体可以将外源基因有效地整合到宿主染色体上，从而达到持久性表达。在感染能力方面可有效地感染神经元细胞、肝细胞、心肌细胞、肿瘤细胞、内皮细胞、干细胞等多种类型的细胞，从而达到良好的的基因治疗效果，在美国已经开展了临床研究，效果非常理想，因此具有广阔的应用前景。

慢病毒的应用

目前慢病毒也被广泛地应用于表达RNAi的研究中。由于有些类型细胞脂质体转染效果差，转移到细胞内的siRNA半衰期短，体外合成siRNA对基因表达的抑制作用通常是短暂的，因而使其应用受到较大的限制。采用事先在体外构建能够表达siRNA的载体, 然后转移到细胞内转录siRNA的策略，不但使脂质体有效转染的细胞种类增加，而且对基因表达抑制效果也不逊色于体外合成siRNA，在长期稳定表达载体的细胞中，甚至可以发挥长期阻断基因表达的作用。在所构建的siRNA表达载体中，是由RNA聚合酶Ⅲ启动子来指导RNA合成的，这是因为RNA聚