凝胶层析法纯化蛋白质的原理是

凝胶层析法分离纯化蛋白质实验

凝胶层析法分离纯化蛋白质

凝胶层析法分离纯化蛋白质实验

【目的】掌握凝胶层析的基本原理 学习利用凝胶层析法分离纯化蛋白质的实验 技能

凝胶层析法分离纯化蛋白质实验

【原理】 凝胶层析也称分子筛层析、排阻层析。 是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用， 根据被分离物质的分子大小不同来进行分 离的技术。

凝胶层析法分离纯化蛋白质实验

凝胶过滤层析凝胶层析是按照蛋

白质分子量大小进行分离的技术，又称之凝胶 过滤、分子筛层析或排 阻层析。

单个凝胶珠本身象“筛子”。不同类型凝 胶的筛孔的大小不同。

凝胶层析法分离纯化蛋白质实验

带网孔的 葡聚糖珠小分子进入 葡聚糖珠内

大分子不 能进入珠 内，经珠 之间缝隙 流出

凝胶过滤层析过程示意图

凝胶层析法分离纯化蛋白质实验

凝胶 珠

凝胶基质

小分子 大分子

凝胶过滤层析过程示意图

凝胶层析法分离纯化蛋白质实验

总结：相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔被完全排 阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，因此流程 较短，移动速度快；所以首先流出。 相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔，可完全 渗透进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，因此流程 较长，移动速率慢；所以最后流出。 中等大小的分子，它们在凝胶颗粒

凝胶层析法测定蛋白质分子质量

一、 实验目的

1、了解凝胶层析的原理及其应用。

2、通过测定蛋白质分子质量的训练，初步掌握凝胶层析技术。 二、 实验原理

凝胶是一种具有立体网状结构且呈多孔的不溶性珠状的颗粒物质。用凝胶来分离物质，主要是根据多孔凝胶对不同半径的蛋白质分子（近似于球形）具有不同的排阻效应实现的。即它是根据分子大小这一物理性质进行分离纯化的。对于某种型号的凝胶，一些大分子不能进入凝胶颗粒内部而完全被排阻在外，只能沿着颗粒间的缝隙流出柱外；而一些小分子不被排阻，可自由扩散，渗透进入凝胶内部的筛孔，而后又被流出的洗脱液带走。分子越小，进入凝胶内部越深，所走的路程越多，故小分子最后流出柱外，而大分子先从柱中流出。一些中等大小的分子介于大分子和小分子之间，只能进入一部分凝胶较大的孔隙，即被部分排阻，因此这些分子从柱中流出的顺序也介于大、小分子之间。这样样品经过凝胶层析后，分子便按照从大到小的顺序依次流出，达到分离的目的。

对于任何一种被分离的化合物在凝胶层析柱中被排阻的范围均在0~100%之间，其被排阻的程度可以用有效分配系数Kav（分离化合物在内水和外水体积中的比例关系）表示，Kav值的大小和凝胶柱床的总体积（Vt）、外水体积（V0）以

蛋白质纯化

一．可溶性蛋白的纯化

方法 AC IEX GF 粗分离 + + - 中度纯化 + + - 精细纯化 - + + 1. 盐析

硫酸铵沉淀法可用于从大量粗制剂中浓缩和部分纯化蛋白质。用此方法可以将主要的免疫球从样品中分离，是免疫球蛋白分离的常用方法。高浓度的盐离子在蛋白质溶液中可与蛋白质竞争水分子，从而破坏蛋白质表面的水化膜，降低其溶解度，使之从溶液中沉淀出来。各种蛋白质的溶解度不同，因而可利用不同浓度的盐溶液来沉淀不同的蛋白质。这种方法称之为盐析。盐浓度通常用饱和度来表示。硫酸铵因其溶解度大，温度系数小和不易使蛋白质变性而应用最广。 硫酸铵分级沉淀的方法其实很简单，一般就是用浓度从低到高的硫酸铵去沉淀蛋白，可以直接在液体里加固体的硫酸铵就可以，到一定的浓度离心沉淀，上清继续加硫酸铵，再离心，上清再加硫酸铵，然后用电泳检测或者活性检测沉淀的效果。

2. 亲和纯化

Tag His GST MBP Strep(II) Flag

Size (aa) 6 218 396 8 8 Capacity (mg/ml) 40 10 10 6 0.6 MW (kDa) 1 26 42.5 1 1 Cleavage TEV/ Thrombin Thr

实验三 凝胶过滤层析法 测定蛋白质分子量

【目的要求】掌握凝胶层析的基本原理学习利用凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量

的实验技能

【原理】凝胶层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用 具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离 物质的分子大小不同来进行分离的技术。

相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔被完全排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，因此流程 较短，移动速度快；所以首先流出。 相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔，可完全 渗透进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，因此流程 较长，移动速率慢；所以最后流出。 中等大小的分子，它们在凝胶颗粒内外部分渗透，渗透的 程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二

者之间，这样分子大的组分先流出，分子小的组分后流出。这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的 顺序依次流出，从而达到了分离的目的。

◎

图3 -1

凝胶层析分离原理示意图

【基本概念】外水体积、内水体积、柱床体积 、洗脱体积 外水体积(Vo)是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积 内水体积(Vi)是指凝胶颗粒中孔穴的体积。柱床体积 是(Vt)凝胶柱所能容纳的总体积。

【基本概念】洗脱体积(Ve)是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗

实验三 凝胶过滤层析法 测定蛋白质分子量

【目的要求】掌握凝胶层析的基本原理学习利用凝胶层析法测定蛋白质相对分子质量

的实验技能

【原理】凝胶层析也称分子筛层析、排阻层析。是利用 具有网状结构的凝胶的分子筛作用，根据被分离 物质的分子大小不同来进行分离的技术。

相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔被完全排阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，因此流程 较短，移动速度快；所以首先流出。 相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔，可完全 渗透进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，因此流程 较长，移动速率慢；所以最后流出。 中等大小的分子，它们在凝胶颗粒内外部分渗透，渗透的 程度取决于它们分子的大小，所以它们流出的时间介于二

者之间，这样分子大的组分先流出，分子小的组分后流出。这样样品经过凝胶层析后，各个组分便按分子从大到小的 顺序依次流出，从而达到了分离的目的。

◎

图3 -1

凝胶层析分离原理示意图

【基本概念】外水体积、内水体积、柱床体积 、洗脱体积 外水体积(Vo)是指凝胶柱中凝胶颗粒周围空间的体积 内水体积(Vi)是指凝胶颗粒中孔穴的体积。柱床体积 是(Vt)凝胶柱所能容纳的总体积。

【基本概念】洗脱体积(Ve)是指将样品中某一组分洗脱下来所需洗

蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤：

（一）材料的预处理及细胞破碎

分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有： 1. 机械破碎法

这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。 2. 渗透破碎法

这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。 3. 反复冻融法

生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。 4. 超声波法

使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。 5. 酶法

如用溶菌酶破坏微生物细胞等。 (二) 蛋白质的抽提

通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。 （三）蛋白质粗制品的获得

选用适当的方法将所要的蛋白质

实验一 蛋白质含量分析（Bradford检测法）

一、 实验目的

1、 制作蛋白质浓度标准曲线；

2、 测定未知蛋白质浓度样品的吸光度，根据标准曲线计算出蛋白质的浓度。

二、 实验原理

Bradford法（考马斯亮蓝法）测定蛋白质浓度是1976年由Bradford建立的，是最常用的蛋白质快速定量方法。该方法根据蛋白质与染料相结合的原理设计，考马斯亮蓝G-250（CBB G-250）在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它在酸性溶液中与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-染料结合物在595nm波长下有最大光吸收，且光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质含量的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1h内保持稳定。

Bradford法的突出优点是：灵敏度高；测定快速、简便，只需加一种试剂；干扰物质少。此法的缺点是：仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物有去污剂、Triton X-100、SDS和0.1N的NaOH。

三、 试剂与器材 1、试剂：

1mg/ml 牛血清蛋白（BSA）母液；考马斯亮蓝G-250；无水乙醇；85%磷酸；Mil

班级：________________ 姓名：________________ 学号：________________ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _装_ _ _ _ _订_ _ _ _ _线_ _ _（装订线内禁止填写答案）_ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____

一、单项选择题,（在备选答案中只有一个是正确的）(本大题共100小题,100分)

1. 维系蛋白质α-螺旋和β-折叠结构稳定的化学键是

A.氢键 B.离子键 C.二硫键 D.疏水作用 E.肽键

(4)氨基酸的疏水侧链很少埋在蛋白质分子的内部 A.1,2,3 B.1,3 C.2,4 D.4 E.1,2,3,4

11. 在电场中，蛋白质泳动速度取决于

A.蛋白质颗粒的大小 B.蛋白质颗粒的形状 C.带净电荷的多少

D.A+C

E.蛋白质所带电荷的多少，分子量的大小

蛋白分离纯化基础知识

概 述 蛋白质的分离纯化是研究蛋白质结构、化学组成 和生物功能的基础。蛋白质在自然界中存在于复杂 的混合体系中，而且许多重要的蛋白质在细胞中的 含量极低。 要把蛋白质从复杂的体系中分离出来， 同时又要防止其组成、结构的改变和生物活性的丧 失，显然是有相当难度的。

原材料的获取

破碎 研磨 超声 渗透压

蛋白溶解 酸、碱 醇 去垢剂 尿素 ……

粗提 沉淀 相分离 分子筛 ……

精提 各种色谱 电泳分离 差速离心 ……

保存 浓缩

保存状态保存条件 保存期限

酶……

……

培训内容 蛋白质样品的预处理 蛋白质常规层析技术 FDA关于蛋白质产品的重要规定

培训内容 蛋白质样品的预处理 蛋白质常规层析技术 FDA关于蛋白质产品的重要规定

预处理 液体材料– 过滤 – 离心

固体材料– 洗涤 – 材料破碎

破碎方法 机械破碎搅拌、振动 研磨 压滤 超声

非机械破碎干燥渗透压 冻融

酶

匀浆

超声破碎频率高于20000HZ的声波称为“超声波”。

缺点：发热，剪切力强，体系中会产生自由基，它可能破坏蛋白 的结构。

渗透压破碎 渗透冲击法破碎 E.Coli表达产物的抽提以渗透冲击法为宜，没有特殊原因 不要使用超声破碎法。 不破坏细胞壁

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第 6章

蛋白质的通性、 纯化和表征

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教学内容一、蛋白质的酸碱性质 二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉淀 三、蛋白质分离纯化的一般原则 四、蛋白质的分离纯化方法

五、蛋白质相对分子质量的测定六、蛋白质的含量测定与纯度鉴定

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一、蛋白质的酸碱性质

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蛋白质的等电点对某种蛋白质来说，在某一pH,它所带的正电荷与负电荷恰 好相等，也即净电荷为零，这一pH,蛋白质的等电点。 有中性盐时，蛋白质等电点在一定程度上决定于介质中离 子的组成。如Ca2+、Mg2+、Cl-、等可与蛋白质某些可解离 基团结合，影响等电点。 无盐类干扰时，蛋白质分子本身的质子供体基团解离出来 的质子数与它的质子受体基团结合的质子数相等时的溶液 pH称为等离子点(isoionic point,或称等离点)。等离子点是 每种蛋白质的一个特征常数。

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教学内容一、蛋白质的酸碱性质 二、蛋白质的胶体性质与蛋白质的沉