土壤纤维素酶测定方法

*33*年第"-期中国饲料

—*-—

纤维素酶酶活的测定方法

河南省科学院生物研究所河南省饲料产品质量监督检验站

刘德海陈小鸽

杨玉华

安明理

饲用纤维素酶在饲料工业中已普及应用，对其质量检测显得日益重要。纤维素酶是一种复合酶，按作用底物的能力划分为两部分，一部分是对棉花纤维素能起催化水解作用的酶，称为!"酶；另一部分是对羧甲基纤维素钠（#$%!&!）起水解作用的酶，称为!’酶。据此，一般采用两种测定方法，一种是适用于!(酶的!&!法，另一种是适用于!"酶的滤纸法。下面就此两种方法作一介绍。

"

!&!（羧甲基纤维素）法")"材料")")"饲用纤维素酶由河南省科学院生物研

究所提供。

")")*试剂磷酸氢二钠、

柠檬酸、羧甲基纤维素、+，,%二硝基水杨酸、氢氧化钠、酒石酸钾钠、亚硫酸钠、苯酚。")")+仪器

-*"型分光光度计、

恒温水浴锅、./0%*酸度计、

秒表。")")1

试剂配制")")1)"2/,)3柠檬酸缓冲液制取3)*45678

磷酸氢二钠液（称取-)

*33*年第"-期中国饲料

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纤维素酶酶活的测定方法

河南省科学院生物研究所河南省饲料产品质量监督检验站

刘德海陈小鸽

杨玉华

安明理

饲用纤维素酶在饲料工业中已普及应用，对其质量检测显得日益重要。纤维素酶是一种复合酶，按作用底物的能力划分为两部分，一部分是对棉花纤维素能起催化水解作用的酶，称为!"酶；另一部分是对羧甲基纤维素钠（#$%!&!）起水解作用的酶，称为!’酶。据此，一般采用两种测定方法，一种是适用于!(酶的!&!法，另一种是适用于!"酶的滤纸法。下面就此两种方法作一介绍。

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!&!（羧甲基纤维素）法")"材料")")"饲用纤维素酶由河南省科学院生物研

究所提供。

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柠檬酸、羧甲基纤维素、+，,%二硝基水杨酸、氢氧化钠、酒石酸钾钠、亚硫酸钠、苯酚。")")+仪器

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磷酸氢二钠液（称取-)

*33*年第"-期中国饲料

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纤维素酶酶活的测定方法

河南省科学院生物研究所河南省饲料产品质量监督检验站

刘德海陈小鸽

杨玉华

安明理

饲用纤维素酶在饲料工业中已普及应用，对其质量检测显得日益重要。纤维素酶是一种复合酶，按作用底物的能力划分为两部分，一部分是对棉花纤维素能起催化水解作用的酶，称为!"酶；另一部分是对羧甲基纤维素钠（#$%!&!）起水解作用的酶，称为!’酶。据此，一般采用两种测定方法，一种是适用于!(酶的!&!法，另一种是适用于!"酶的滤纸法。下面就此两种方法作一介绍。

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!&!（羧甲基纤维素）法")"材料")")"饲用纤维素酶由河南省科学院生物研

究所提供。

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柠檬酸、羧甲基纤维素、+，,%二硝基水杨酸、氢氧化钠、酒石酸钾钠、亚硫酸钠、苯酚。")")+仪器

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磷酸氢二钠液（称取-)

生物化学实验报告

题目：纤维素酶活力的测定（3,5-二硝基水杨酸法）

姓名： 学号： 班级： 时间：

一、

实验目的：

掌握还原糖的测定原理，学习用3,5-二硝基水杨酸法测定还原糖的方法。

二、

实验原理：

纤维素酶水解纤维素，产生纤维二糖、葡萄糖等还原糖，能将3,5-二硝基水杨酸中硝基还原成橙黄色的氨基化合物，利用比色法测定其还原物生成量来表示酶的活力。 三、

实验试剂：

1. 3,5-二硝基水杨酸显色液：称取10g 3,5-二硝基水杨酸，溶入蒸馏水中，

加入20g分析纯氢氧化钠，200g酒石酸钾钠，加水500ml，升温溶解后，加入重蒸酚2g，无水亚硫酸钠0.5g。加热搅拌，待全溶后冷却，定容至1000ml。存于棕色瓶中，放置一周后使用。 2. 0.1摩尔pH4.5乙酸-乙酸钠缓冲溶液。

3. 0.5%羧甲基纤维素钠水溶液，溶解后成胶状液，静置过夜。使用前摇匀。 4. 标准葡萄糖溶液：称取干燥至恒重的葡萄糖100mg，溶解后定容至100ml，

此溶液含葡萄糖1.00mg/ml。

5. 酶液：将0.05g酶溶解定容至50ml，从中取出1ml再定容至100ml，待

测。（用pH4.5乙酸-乙酸钠缓冲溶液配制）

四、

实验二、黑曲霉发酵生产纤维素酶大实验

一、实验目的

1、了解纤维素酶的生产工艺和原理 2、掌握液体发酵和固体发酵工艺

3、学会DNS法测定还原糖含量的方法和原理 二、实验原理

纤维素酶可以用于一切含纤维素的生物质的降解，具有广阔的应用前景。高产纤维素酶的微生物主要有木霉属、曲霉属、根霉属，黑曲霉所产的纤维素酶中β-葡萄糖苷酶活力高，能避免酶解产物纤维二糖的阻遏作用，而且安全无毒，故而成为生产纤维素酶的主要菌种之一。纤维素酶是诱导酶，故发酵生产时需有纤维素物质作诱导剂。

以羧甲基纤维素钠作底物，用发酵所得纤维素酶对底物进行酶解，测定酶解液中的还原糖含量（以葡萄糖计），可以计算酶活力高低。还原糖与DNS反应形成棕色物质，颜色深浅与糖含量成正比。 三、材料与试剂配制

1、生产菌种：黑曲霉

2、斜面（活化）培养基：酵母膏0.4%，蛋白胨0.6%，可溶性淀粉1%，葡萄糖0.9%，马玲薯浸出液7%，琼脂2%，陈海水（或人工海水）配制，pH7.0-7.4。

3、人工海水：NaCl = 24 g/L ;MgSO4·7H2 O = 7.0 g/L ;NH4NO3 = 1 g/L ;KCl = 0.7 g/ L ; NaH2PO4 = 2.0 g/ L ;N

实验原理

植物的主要化学成分是纤维素、半纤维素和木质素这三部分。它们是构成植物细胞壁的主要组分。其中，纤维素组成微细纤维，构成纤维细胞壁的网状骨架，而半纤维素和木质素是填充在纤维和微细纤维之间的“粘合剂”和“填充剂”。 1. 纤维素

生物制粉末在加热的情况下用醋酸和硝酸的混合液处理，在这种情况下，细胞间的物质被溶解，纤维素也分解成单个的纤维，木质素、半纤维素和其它的物质也被除去。淀粉、多缩戊糖和其它物质受到了水解。用水洗涤除去杂质以后，纤维素在硫酸存在下被重铬酸钾氧化成二氧化碳和水。

C6H10O5 + 4K2Cr2O7 + 16H2SO4 = 6CO2 + 4Cr2(SO4)3 + 4K2SO4 + 21H2O

过剩的重铬酸钾用硫酸亚铁铵溶液滴定，再用硫酸亚铁铵滴定同量的但是未与纤维素 反应的重铬酸钾，根据差值可以求得纤维素的含量。 2. 半纤维素

用沸腾的80％硝酸钙溶液使淀粉溶解，同时将干扰测定半纤维素的溶于水的其它碳水化合物除掉。将沉淀用蒸馏水冲洗以后，用较高浓度的盐酸，大大缩短半纤维素的水解时间，水解得到的糖溶液，稀释到一定体积，用氢氧化钠溶液中和，其中的总糖量用铜碘法测定。

铜

目 录

实验一 产纤维素酶菌种的分离与初筛 实验二 产纤维素酶菌种的复筛与保藏 实验三 酶活测定与传代保藏

实验四 产纤维素酶菌种的紫外诱变育种 实验五 产纤维素酶菌种的产酶条件优化

实验六 产纤维素酶菌种的产酶条件优化的结果分析

实验一 产纤维素酶菌种的分离与初步鉴定

一、实验目的

1．了解产纤维素酶微生物分离的基本原理； 2．掌握产纤维素酶微生物分离的操作方法。

二、实验原理

自然界中存在大量的纤维素类物质，同时存在着很多能分解纤维素类物质的生物，小到

细菌、放线菌、真菌，大到一些食草类昆虫与动物。这些生物与绿色植物一起构成了这个世界的碳循环。在发酵堆肥中，存在着大量的，耐高温的纤维素分解菌株，但多半都为混合分解，菌种需要：

1. 内切型葡萄糖苷酶（endo-1,4-β-D-glucanase,EC3.3.1.4,简称EBG），也称Cx酶、CMC

酶、EG。这类酶作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机识别并水解β-1,4-糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量非还原性末端的小分子纤维素； 2. 外切型葡萄糖苷酶（exo-1,4-β-D-glucanase,EC3.2.1.91），也称C1酶、微晶纤维素酶、

纤维二糖水解酶（Cell

从微生物纤维素酶的来源、性质、分子结构及作用机理等四个方面详细概述了国内外微生物纤维素酶及其降解纤维素机理的研究现状,并提出微生物纤维素酶降解纤维素的研究方向,对今后在微生物纤维酶及其降解机理方面的进一步研究有重要的指导意义。

8 6

陕

西

农

业

科

学

21() 0 0 3

农艺探讨

微生物纤维素酶及其降解纤维素机理的研究进展王翮

(安职业技术学院生物工程系，西西安西陕摘

7 07 ) 1 0 7

要：微生物纤维素酶的来源、质、子结构及作用机理等四个方面详细概述了国内外微生物纤维素酶从性分

及其降解纤维素机理的研究现状，并提出微生物纤维素酶降解纤维素的研究方向，今后在微生物纤维酶及对

其降解机理方面的进一步研究有重要的指导意义。关键词：生物纤维素；纤维素酶；降解微

纤维素是地球上最丰富的多糖化合物，泛广存在于如树杆等植物中，全世界每年生产的纤维素及半纤维素总量在 8 0亿 t] 5[。将纤维素水解 1为小分子单糖，糖再通过微生物发酵生产各种单有用的产品，藉此有望有效利用这些源源不断的

酶一般最适 p为中性至偏碱性，且对天然纤 H并维素的水解作用较弱L。在草食动物的消化 6]道，特别是反刍动物的瘤胃中也存在一些可以分

解纤维素的细菌类群。一些类群的放线菌也可以产生纤维素

FOOD SCIENCE AND TECHNOLOGY

食品科技

2010年第 35卷第 12

期

纤维素酶是具有纤维素降解能力酶的总称, 其应用非常广泛,如蔬菜加工,果汁及粮食加工、天然有效成分的提取、饲料、造纸、纺织工业、采油工程、废水处理以及能源制造等方面 [1-3]。目前纤维素酶的分离纯化多采用盐析、凝胶色谱等方法。

双水相体系萃取具有条件温和,产品活性损失少,处理量大,设备投资小,操作简单,易于放大及连续操作等优点,广泛应用于蛋白质、酶、核酸及多糖等生物大分子的分离纯化 [4]。本课题以商业粗酶制剂为酶源,研究 PEG 浓度、硫酸铵浓度

及 pH 对 PEG4000/(NH4 2SO 4双水相体系萃取纤维素酶的影响,以确定合适的萃取条件。 1材料与方法 1.1

材料

纤维素酶:杭州绿柔生物科技有限公司;羧甲基纤维素钠:上海精析化工科技有限公司;聚乙二醇 4000:天津科密欧化学试剂开发中心。 1.2方法 1.2.1

纤维素酶活力测定

以柠檬酸 -硫酸氢二钠

Extraction of cellulase by aqueous two-phase system

SHU Guo-wei, WANG Chang-feng, CHEN He, YANG Zhi-w

4881（2011）03-0006-03文章编号：1009-DOI：10．3969/j．issn．1009-4881．2011．03．002

产纤维素酶霉菌的筛选及初步鉴定

陈

燕，王小芬，金

伟，胡申才，曾

驰

（武汉工业学院生物与制药工程学院，湖北武汉430023）

摘

要：在长期有腐烂植物的潮湿处采集8种样品，用羧甲基纤维素液体培养基富集培养，分

离得到34株产纤维素酶的霉菌。利用刚果红染色法对所得菌株进行染色并以水解圈/菌落直

径大小为筛选标准进行初筛，得到11株菌。再用DNS法测定初筛所得菌株发酵液中纤维素

wx1005，酶的活力，得到两株纤维素酶活性较高的菌株wx0503、其发酵液纤维素酶活力分别可47．46U/mg。此外，达31．31U/mg、用苏丹混合液染色法对初筛所得到的产纤维素酶菌株染

wx1007。色，镜检观察其产油脂情况，得到2株产油量较大的纤维素酶产生菌株wx0403、关键词：纤维素酶；真菌；酶活；油脂

中图分类号：Q939．96

文献标识码：A

Screeningandcharacterizationofcellulase－producingfungistrains

CHENYan，WANGXiao－fen，JINWei，HUShen－cai，Z