基因工程原理与实验指导

基因工程试题库

001 基因工程操作的三大基本元件是【 】 I 供体 II 受体 III 载体 IV 抗体 V 配体 Ａ I + II + III Ｂ I + III + IV Ｃ II + III + IV Ｄ II + IV + V Ｅ III + IV + V

002 根据当今生命科学理论，基因工程的用途是【 】

I 分离纯化基因 II 大量生产生物分子 III 构建新型物种 IV 提高基因重组效率 Ａ I + II + III Ｂ I + II + IV Ｃ I + III + IV Ｄ II + III + IV

Ｅ I + II + III + IV

003 基因工程的三大理论基石是【 】 Ａ 经典遗传学、细胞生物学、微生物学 Ｂ 分子遗传学、分子生物学、生化工程学 Ｃ 动物学、植物学、微生物学

Ｄ 生物化学、生化工程学、化学工程学 Ｅ 生理学、仿生学、免疫学

004 根据基因工程的定义，下列各名词中不能替代基因工程的是【 】 Ａ 基因诱变 Ｂ 分子克隆 Ｃ DNA重组 Ｄ 遗传工程

Ｅ 基因无性繁殖

005 基因工程的单元操作顺序是【 】 Ａ 增，转，检，切，接 Ｂ 切，接，转，增，检 Ｃ 接，转，增，检，切 Ｄ 检，

基因工程原理

内容提要

1. 基因工程又称基因操作、重组DNA技术, 是P. Berg等于1972年创建的。基因工程技术涉及的基本过程包括

“切、连、转、选”。该技术有两个基本的特点∶分子水平上的操作和细胞水平上的表达。

2. 基因工程中使用多种工具酶，包括限制性内切核酸酶、DNA连接酶和其他一些参与DNA合成与修饰的酶类。 3. 限制性内切核酸酶是基因工程中最重要的工具酶，属于水解酶类。根据限制性内切核酸酶的作用特点，被分为

三大类。Ⅱ类限制性内切核酸酶是基因工程中最常用的酶，该类酶的分子量小，专一性强,切割的方式有平切和交错切, 作用时需要Mg++作辅助因子, 但不需要ATP和SAM。第一个被分离的Ⅱ类酶是Hind Ⅱ。

4. 连接酶是一类用于核酸分子连接形成磷酸二酯键的核酸酶，有DNA连接酶和RNA连接酶之分。基因工程中

使用的连接酶来自于原核生物，有两种类型的DNA连接酶∶E.coliDNA连接酶和T4-DNA连接酶。基因工程中使用的主要是T4DNA连接酶，它是从T4噬菌体感染的E.coli中分离的一种单链多肽酶，既能进行粘性末端连接又能进行平末端连接。

5. 载体是能将分离或合成的基因导入细胞的DNA分子，有三种主要类型∶质粒DN

1.动物细胞DNA提取原理是什么?

答：先用SDS裂解细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸。然后用等体积酚/氯仿/异戊醇抽提，使蛋白质变性沉降到酚与水相的界面，DNA则留在水相中，离心后在上清液中加入醋酸钠和两倍体积无水乙醇，除去多糖物质和沉淀DNA，然后离心后沉淀用70%乙醇洗涤，最后用ddH2O溶解沉淀DNA，－20℃保存。 2.DNA提取中用到了哪些试剂？有什么作用？

EDTA:二价金属离子螯合剂，螯合Mg2+，抑制DNA酶活性。因为Mg离子是DNA酶的辅因子。

SDS:一种阴离子去污剂，在高温（55℃—65℃）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸。 酚:使蛋白质变性。

氯仿:作为除杂剂，除去糖、脂等杂质；加速有机相与液相分离；抽提核酸溶液中残留的酚。 乙丙醇:作为消泡剂；降低DNA的水溶性，让DNA从溶液中析出；有利于分层，使离心后的上层含DNA水相，中间的蛋白质相及下层有机溶液相维持稳定。 无水乙醇:降低DNA的水溶性，沉淀DNA。

醋酸纳:调PH，中和Tris-Buffer，形成中性环境，利于DNA沉淀。 Tris-Buffer（PH8.0）:提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏。 70％乙醇:清洗溶液中离子及

总 论

基因是遗传的基本单位，所以基因工程有时称遗传工程(genetic engineering),有时还称为基因克隆(gene cloning)、分子克隆(molecular cloning)。基因工程的基本技术是DNA重组技术(recombinant DNA technigue)，其定义是在分子水平上，用人工方法提取(或合成)不同生物的遗传物质，在体外切割、拼接和重新组合，然后将体外重组的DNA分子引入受体细胞，使外源DNA在受体细胞中进行复制与表达。按人们的需要生产不同的产物或定向地创造生物的新性状，并使之稳定地遗传给后代。了解这个概念要注意两个问题，第一就是必须有体外DNA的切割、连接、重组过程。第二，DNA重组必须是有目的的，按事先设计的过程进行，随意的切割、连接、重组过程不是基因工程。 一、DNA体外重组的主要步骤

DNA体外重组可分五个步骤。 (一)目的基因和载体基因的制备

制备带有目的基因的DNA片段和载体基因。 1．带有目的基因的DNA片段的获得

带有目的基因的DNA片段的获得，主要有两个途径：一是从已有的生物基因组中分离；二是用酶学或化学的方法合成。

从生物基因组中分离DNA片段主要是提取基因组DNA，对

一.基因工程的概念：

1.限制性内切酶:识别双链DNA内部特异位点并裂解磷酸二酯键，在特定部位限制性地切割 DNA分子。

2.Southern杂交:将带有互补的特定核苷酸序列的单链DNA或RNA混合在一起，其相应的同源区段就会退火形成双链结构。如果退火的核酸来自不同的生物有机体，所形成的双链分子就被称为杂种核酸分子。

3.Northern杂交:是将RNA分子从电泳凝胶转移到硝酸纤维素滤膜或其他化学修饰的活性滤纸上，进行核酸杂交的一种实验方法。

4.反义RNA技术:反义RNA 是指与靶RNA 具有互补序列的RNA 分子, 它通过与靶RNA 进行碱基配对结合调节结构基因的表达。 二.需要了解的简单知识 1.限制性内切酶的分类

Ⅰ型限制性内切酶：多聚体蛋白质，具有切割DNA的功能，作用时需要ATP、Mg2+和S-腺苷蛋氨酸的存在。切割DNA的方式是，先与双链DNA上未加修饰的识别序列相互作用，然后沿着DNA分子移动，在行进相当于1000~5000个核苷酸的距离之后在随机位置上切割单链DNA。

Ⅱ型限制性内切酶：分子量较小的单体蛋白，作用时仅需要Mg2+存在即可维持活性，它可在特殊位点切割DNA，产生具有黏性末端或其他形式的DNA分子片段

总 论

基因是遗传的基本单位，所以基因工程有时称遗传工程(genetic engineering),有时还称为基因克隆(gene cloning)、分子克隆(molecular cloning)。基因工程的基本技术是DNA重组技术(recombinant DNA technigue)，其定义是在分子水平上，用人工方法提取(或合成)不同生物的遗传物质，在体外切割、拼接和重新组合，然后将体外重组的DNA分子引入受体细胞，使外源DNA在受体细胞中进行复制与表达。按人们的需要生产不同的产物或定向地创造生物的新性状，并使之稳定地遗传给后代。了解这个概念要注意两个问题，第一就是必须有体外DNA的切割、连接、重组过程。第二，DNA重组必须是有目的的，按事先设计的过程进行，随意的切割、连接、重组过程不是基因工程。 一、DNA体外重组的主要步骤

DNA体外重组可分五个步骤。 (一)目的基因和载体基因的制备

制备带有目的基因的DNA片段和载体基因。 1．带有目的基因的DNA片段的获得

带有目的基因的DNA片段的获得，主要有两个途径：一是从已有的生物基因组中分离；二是用酶学或化学的方法合成。

从生物基因组中分离DNA片段主要是提取基因组DNA，对

总 论

基因是遗传的基本单位，所以基因工程有时称遗传工程(genetic engineering),有时还称为基因克隆(gene cloning)、分子克隆(molecular cloning)。基因工程的基本技术是DNA重组技术(recombinant DNA technigue)，其定义是在分子水平上，用人工方法提取(或合成)不同生物的遗传物质，在体外切割、拼接和重新组合，然后将体外重组的DNA分子引入受体细胞，使外源DNA在受体细胞中进行复制与表达。按人们的需要生产不同的产物或定向地创造生物的新性状，并使之稳定地遗传给后代。了解这个概念要注意两个问题，第一就是必须有体外DNA的切割、连接、重组过程。第二，DNA重组必须是有目的的，按事先设计的过程进行，随意的切割、连接、重组过程不是基因工程。 一、DNA体外重组的主要步骤

DNA体外重组可分五个步骤。 (一)目的基因和载体基因的制备

制备带有目的基因的DNA片段和载体基因。 1．带有目的基因的DNA片段的获得

带有目的基因的DNA片段的获得，主要有两个途径：一是从已有的生物基因组中分离；二是用酶学或化学的方法合成。

从生物基因组中分离DNA片段主要是提取基因组DNA，对

基因工程原理练习题及其答案

一、填空题 1． 基因工程是70年代发展起来的遗传学的一个分支学科。 2． 基因工程的两个基本特点是： (1)分子水平上的操作，(2)细胞水平上的表达

3． 基因克隆中三个基本要点是：克隆基因的类型；受体的选择；载体的选择

4． 通过比较用不同组合的限制性内切核酸酶处理某一特定基因区域所得到的不同大小 的片段，可以构建显示该区域各限制性内切核酸酶切点相互位置的限制性酶切图谱。 5． 限制性内切核酸酶是按属名和种名相结合的原则命名的，第一个大写字母取自属名的第一个字母，第二、三两个字母取自_种名的前两个字母，第四个字母则用株名表示。 6．部分酶切可采取的措施有：(1)减少酶量；(2)缩短反应时间；(3)增大反应体积等。

7．第一个分离的限制性内切核酸酶是EcoK；而第一个用于构建重组体的限制性内切核酸酶是_ EcoRl。 8．限制性内切核酸酶BsuRI和HaeⅢ的来源不同，但识别的序列都是GGCC，它们属于异源同工酶。

9．DNA聚合酶I的Klenow大片段是用_枯草杆菌蛋白酶切割DNA聚合酶I得到的分子量为76kDa的大片段，具有两种酶活性： (1) 5'-3'合成酶的活性； (2) 3'-5'外切

基因工程原理练习题及其答案

一、填空题 1． 基因工程是70年代发展起来的遗传学的一个分支学科。 2． 基因工程的两个基本特点是： (1)分子水平上的操作，(2)细胞水平上的表达

3． 基因克隆中三个基本要点是：克隆基因的类型；受体的选择；载体的选择

4． 通过比较用不同组合的限制性内切核酸酶处理某一特定基因区域所得到的不同大小 的片段，可以构建显示该区域各限制性内切核酸酶切点相互位置的限制性酶切图谱。 5． 限制性内切核酸酶是按属名和种名相结合的原则命名的，第一个大写字母取自属名的第一个字母，第二、三两个字母取自_种名的前两个字母，第四个字母则用株名表示。 6．部分酶切可采取的措施有：(1)减少酶量；(2)缩短反应时间；(3)增大反应体积等。

7．第一个分离的限制性内切核酸酶是EcoK；而第一个用于构建重组体的限制性内切核酸酶是_ EcoRl。 8．限制性内切核酸酶BsuRI和HaeⅢ的来源不同，但识别的序列都是GGCC，它们属于异源同工酶。

9．DNA聚合酶I的Klenow大片段是用_枯草杆菌蛋白酶切割DNA聚合酶I得到的分子量为76kDa的大片段，具有两种酶活性： (1) 5'-3'合成酶的活性； (2) 3'-5'外切

基因工程载体

---乳酸菌表达载体pMG36e及其应用现状

目前，多数外源基因的克隆与表达，主要采用大肠杆菌。然而，由于大肠杆

菌能够引起人类和动物发生不同程度的腹泻，导致机体损伤，所以其表达产物需要经过复杂的分离纯化才能达到食品医药标准。与之相比，乳酸菌作为人和动物肠道内正常菌群之一，已被证明具有诸多益生功能，而且被公认为安全无毒的 (Generally regarded as safe，GRAS)。因此，采用乳酸菌表达的外源蛋白质可免去上述复杂、繁琐的后提纯工艺；同时，乳酸菌可以在肠道中存活定植，其外源基因表达用于治疗或免疫作用的活性物质可以持续地在肠道中产生，成为人和动物体内功能性生物制剂的“加工车间”，从而起到相应的保护和治疗性作用。

乳酸菌（Lacticacidbacteria，LAB）是一类能够发酵糖类产生乳酸的革兰氏阳性细菌［1］，具有诸如缓解乳糖不耐症、调节消化道微生态平衡等益生作用，应用领域十分广泛。随着近二十几年来分子生物学的发展，以乳酸菌作为宿主，利用质粒表达外源基因，对乳酸菌进行改造以进一步提高其功能已成为目前的研究热点之一。乳酸菌常用质粒载体主要有pWV01衍生载体，pNZ系列载体［2］等。质粒pMG36e来源