mtt检测法

MTT法活性筛选步骤

材料 试剂：

二甲亚砜（DMSO）分析纯 灭菌PBS, pH 7.4

MTT储存液（5mg/mL）：配制于灭菌PBS，-20摄氏度保存 工作液MTT：储存液用灭菌PBS稀释5倍使用。

MTT法筛选步骤 一、接种细胞

1. 将培养在100mm培养皿的对数生长期细胞去掉培养基，用5ml灭菌PBS洗涤一次 2. 去掉PBS，用胰酶消化制成单细胞悬液

3. 用血球计数板计数细胞悬液浓度，根据需要接种细胞量，吸取相应体积细胞悬液，用

培养液稀释至相应体积，混匀，使细胞浓度为5×104/ml.

4. 向96孔细胞培养板中每孔加入100ul细胞稀释悬液，空白组加入等量培养液，未加细

胞悬液的孔加入等量PBS缓冲液。 5. 培养板放入37℃，5% CO2培养箱中培养24h。

接种前的细胞必须状态良好，且不能太密集。否则不能接种。

接种时要不时摇晃细胞悬液，保证接种密度均匀。接种密度不均匀是造成误差的主要原因。

二、药物准备、药物处理

实验前开紫外照射细胞间、超净台及配药用离心管。 1. 待测样品用DMSO配成浓度为50mg/ml母液。

2. 用培养液将配好的50mg/ml母液稀释至100ug/ml，再用100ug/ml药物稀释成不同浓

度（

MTT法绘制生长曲线

一 细胞生长曲线：

A、目的：学习细胞生长曲线的测定方法，观察细胞生长基本规律。

B、背景知识

细胞生长曲线是观察细胞生长基本规律的重要方法。只有具备自身稳定生长特性的细胞才适合在观察细胞生长变化的实验中应用。因而在细胞系细胞和非建系细胞生长特性观察中，生长曲线的测定是最为基本的指标。

原理（选填项目）：

细胞生长曲线的测定一般可利用细胞计数法进行。

C、材料

（一）仪器

1. 净化工作台

2. 离心机

3. 恒温水浴箱

4. 冰箱（4℃、-20℃）

5. 倒置相差显微镜

6. 培养箱（37℃、5%CO2、饱和湿度）

（二）玻璃器皿

1. 吸管（弯头）

2. 培养瓶

3. 玻璃瓶（250ml、100ml）

4. 废液缸

（三）塑料器皿

1. 吸头

2. 枪头

3. 24培养板

4. 胶塞

（四）其他物品

1. 微量加样枪

2. 红血球计数板

（五）试剂

1. D-Hanks液

2. 小牛血清

3. RPMI1640

4. 双抗（青霉素、链霉素）

5. 0.08%胰酶

（四）、操作步骤

1. 取生长状态良好的细胞，采用一般传代方法进行消化，制成细胞悬液；

2. 计数，精确地将细胞分别接种于21～30个大小一致的培养瓶内或培养孔（以24孔培养板为宜），每瓶或孔细胞总数要求一致，加入培养液的量也要

MTT法绘制生长曲线

一 细胞生长曲线：

A、目的：学习细胞生长曲线的测定方法，观察细胞生长基本规律。

B、背景知识

细胞生长曲线是观察细胞生长基本规律的重要方法。只有具备自身稳定生长特性的细胞才适合在观察细胞生长变化的实验中应用。因而在细胞系细胞和非建系细胞生长特性观察中，生长曲线的测定是最为基本的指标。

原理（选填项目）：

细胞生长曲线的测定一般可利用细胞计数法进行。

C、材料

（一）仪器

1. 净化工作台

2. 离心机

3. 恒温水浴箱

4. 冰箱（4℃、-20℃）

5. 倒置相差显微镜

6. 培养箱（37℃、5%CO2、饱和湿度）

（二）玻璃器皿

1. 吸管（弯头）

2. 培养瓶

3. 玻璃瓶（250ml、100ml）

4. 废液缸

（三）塑料器皿

1. 吸头

2. 枪头

3. 24培养板

4. 胶塞

（四）其他物品

1. 微量加样枪

2. 红血球计数板

（五）试剂

1. D-Hanks液

2. 小牛血清

3. RPMI1640

4. 双抗（青霉素、链霉素）

5. 0.08%胰酶

（四）、操作步骤

1. 取生长状态良好的细胞，采用一般传代方法进行消化，制成细胞悬液；

2. 计数，精确地将细胞分别接种于21～30个大小一致的培养瓶内或培养孔（以24孔培养板为宜），每瓶或孔细胞总数要求一致，加入培养液的量也要

细胞增殖检测：MTT实验经验总结

MTT分析法以活细胞代谢物还原剂3-（4，5）-dimethylthiahiazo （-z-y1）-3，5-di- phenytetrazoliumromide， MTT噻唑蓝为基础。MTT为黄色化合物，是一种接受氢离子的染料，可作用于活细胞线粒体中的呼吸链，在琥珀酸脱氢酶和细胞色素C的作用下tetrazolium环开裂，生成蓝色的formazan结晶，formazan结晶的生成量仅与活细胞数目成正比（死细胞中琥珀酸脱氢酶消失，不能将MTT还原）。还原生成的formazan结晶可在含50%的N，N-二甲基甲酰胺和20%的十二甲基磺酸钠（pH 4.7）的MTT溶解液中溶解，利用酶标仪测定490 nm处的光密度OD值，以反映出活细胞数目。也可以用DMSO来溶解。

MTT粉末和溶液保存时都需要避光，用铝箔纸包好就可以。实验的时候我一般关闭超净台上的日光灯来避光，觉得这样比较好。 一、步骤 1、接种细胞

用含10%胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000－10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul。 2、培养细胞

同一般培养条件，培养3－5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。 3、呈色

培养3－

MTT：

MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，汉

语化学名为3-(4，5-二甲基噻唑-2)-2，5-二苯基四氮唑溴盐，简称：四唑盐。商品名：噻唑蓝。是一种黄颜色的染料。

原理：

MTT产品为淡黄色粉末，易被水溶解和透过细胞膜而进入细胞内，被活细胞线粒体脱氢酶还原形成不溶于水的蓝紫色甲臢结晶并沉积于细胞中，死细胞和红细胞无这种能力。结晶物形成的量与细胞数量和代谢活性成比例，因此吸光度A值大小可以反映细胞数量和活性。 在细胞MTT法测定过程中，细胞还原MTT所形成的甲臢培养物不溶于细胞液，需加入有机溶剂使细胞裂解，甲臢颗粒溶解便于比色。

应用：

该方法已广泛用于一些生物活性因子的活性检测、大规模的抗肿瘤药物筛选、细胞毒性试验以及肿瘤放射敏感性测定等。

评价：

优点：特异性强、灵敏度高、快速、准确、重复性好。

缺点：由于MTT经还原所产生的甲臜产物不溶于水，需被溶解后才能检测。这不仅使工作量增加，也会对实验结果的准确性产生影响，而且溶解甲的有机溶剂对实验者也有损害。

方法：

①制备靶细胞（适宜浓度）。②加入待测的细胞因子或化学药物，37 ℃、5

　　　　天然产物研究与开发　　　　　　Vol.11　No.3N ATURAL PRODU CT RESEARCH AND DEVE LO PM EN T 　　　　　　　　　　　　

　　收稿日期:1999-01-07抗肿瘤药物筛选中M T T 法和SRB 法的比较

谭卫东　金　红　罗弟祥　钟绍东　苏　芝　彭旭东　高小平

(中国科学院成都地奥制药公司　成都　610041)

摘　要　在抗肿瘤药物的体外筛选中,M T T 法和SRB 法是常用的两种方法。我们用

M T T 法和SRB 法分别测定3种已知植物抗癌药对22株人肿瘤细胞的抗癌活性,对这

两种方法进行了详细的比较。通过分析两种方法测出的细胞存活率(T /C)的差异分布

和相关系数以及IC 50的二变量分布,比较了两种方法测定结果的异同;通过两种方法重

复测定3种药物对7株人癌细胞的抗癌活性,比较了两种方法的重复性;通过分析两种

方法测定结果T /C 值随时间变化的程度,比较了两种方法测定结果的稳定性。实验结

果表明:M T T 法和SRB 法的相关性较好,都可用于抗肿瘤药物的体外筛选,SRB 法更

适合于大规模筛选,3种抗癌药物的测定结果与临床资料基本一致。

关键词　M T T 法,SRB 法,抗肿瘤药物体外筛选抗

在园中看了很多帖子，在网上也查了很多帖子，但是都没有详细介绍如何用SPSS处理MTT结果的详细步骤（大家都是轻描淡写，也没有教详细的步骤），经过自己查阅书籍将具体的

方法总结如下，方便各位战友的学习。希望版主能加分！！！

SPSS处理MTT结果的方法及步骤

一、如下表所示：我们需要计算出某一浓度下某个时间点的细胞抑制率，并对计算出的数据进行统计学处理，比较（1）：同一浓度下不同时间点的细胞抑制率是否有统计学差异；（2）：相同时间不同浓度下的细胞抑制率是否有统计学差异；

不同浓度某药物作用下某种细胞株的生长抑制率 (`x±SD )( % ) ( n=3 )

浓度(?mol/L) 24h 48h 72h 200 150 100 50 25 12.5

1、选择统计学方法

单因素方差分析

2、处理原始数据

图中抑制率1、抑制率2、抑制率3分别代表重复三次的实验数据。

将上述原始数据分别变成下列形式以利于SPSS中的计算

3、打开SPSS输入数据（以下以同一浓度不同时间为例做示范）

4、修改变量视图

5、设定值

在园中看了很多帖子，在网上也查了很多帖子，但是都没有详细介绍如何用SPSS处理MTT结果的详细步骤（大家都是轻描淡写，也没有教

MTT实验

MTT实验第一阶段 细胞培养：细胞传代与冻存…（此处略，苹果你已会！）

MTT实验第二阶段（自己总结）

细胞种板：往96孔板中接种适宜数量的细胞，并保证细胞在96孔板小孔中均匀分布，正常生长，是MTT实验成功的首要条件。

主要步骤：

（1）.细胞生长：保证细胞处于对数生长期，简而言之就是将已基本铺满培养瓶底的细胞进行消化，但不传代，就是将旧的培养基换掉，让贴壁的细胞悬浮，并培养一天。此时细胞处于对数生长期，细胞活力最好，有利于MTT实验的结果。

（2）.细胞消化：将昨天的细胞吸去旧的培养基（将死细胞吸走，可用过滤灭菌的PBS溶液轻轻冲洗细胞），加入胰酶消化，随后加入适宜培养基（不宜过多，勿将细胞稀释的过稀，达不到种板所需的细胞浓度要求）。切记利用吹打管将细胞吹打均匀（大量细胞会聚集在一起，细胞分散不均，吹打不匀会影响细胞计数的准确性及随后种板的均一性）；但吹打过猛过多也会影响细胞活力。

（3）.细胞计数：计数之前，应用75%酒精将计数器其载玻片擦拭干净，以免上面残留杂质影响细胞计数。取一小滴（估计20ul左右）吹打均匀的细胞培养液沿细胞计数器上端凹槽轻轻缓慢打出滴下，此时小液滴会自动（虹吸原理）铺满细胞计算器的上部小方块（如图1

MTT原理：

MTT全称为3-(4,5)-dimethylthiahiazo (-z-y1)-3,5-di- phenytetrazoliumromide，是一种黄颜色的染料。活细胞线粒体中琥珀酸脱氢酶能够代谢还原MTT，同时在细胞色素C的作用下，生成蓝色（或蓝紫色）不溶于水的甲臜（Formazan），甲臜的多少可以用酶标仪在570nm 处进行测定。在通常情况下，甲臜生成量与活细胞数成正比，因此可根据光密度OD值推测出活细胞的数目。由于死细胞中不含琥珀酸脱氢酶，因此加入MTT 不会有反应。

MTT 溶液的配制方法：

通常，此法中的 MTT 浓度为5mg/ml。因此，可以称取MTT 0.5克，溶于100 ml的磷酸缓冲液（PBS）或无酚红的培养基中，用0.22μm滤膜过滤以除去溶液里的细菌，放4℃ 避光保存即可。在配制和保存的过程中，容器最好用铝箔纸包住。

需要注意的是，MTT法只能用来检测细胞相对数和相对活力，但不能测定细胞绝对数。在用酶标仪检测结果的时候，为了保证实验结果的线性，MTT 吸光度最好在0-0.7 范围内。

实验步骤：

（1）接种细胞：用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000－10000个细胞接种到96孔板，每孔体积20

MTT大汇总

实验前应明确的问题

1. 选择适当的细胞接种浓度。一般情况下，96孔培养板的一内贴壁细胞长满时约有10个细胞。但由于不同细胞贴壁后面积差异很大，因此，在进行MTT试验前，要进行预实验检测其贴壁率、倍增时间以及不同接种细胞数条件下的生长曲线，确定试验中每孔的接种细胞数和培养时间，以保证培养终止致细胞过满。这样，才能保证MTT结晶形成酌量与细胞数呈的线性关系。否则细胞数太多敏感性降低，太少观察不到差异。

2. 药物浓度的设定。一定要多看文献，参考别人的结果再定个比较大的范围先初筛。根据自己初筛的结果缩小浓度和时间范围再细筛。切记！否则，可能你用的时间和浓度根本不是药物的有效浓度和时间。

3. 时间点的设定。在不同时间点的测定OD值，输入excel表，最后得到不同时间点的抑制率变化情况，画出变化的曲线，曲线什么时候变得平坦了（到了平台期）那个时间点应该就是最好的时间点（因为这个时候的细胞增殖抑制表现的最明显）。

4. 培养时间。200ul的培养液对于10的4~5次方的增殖期细胞来说，很难维持68h，如果营养不够的话，细胞会由增殖期渐渐趋向G0期而趋于静止，影响结果，我们是在48h换液的。

5. MTT法只能测定细胞相对数和相对活