流式细胞分析技术中

流式细胞仪分析技术及应用

第一节 概述 第四节 流式细胞仪技术的要求 一、工作原理 第五节、流式细胞仪的科研应用 二、散射光的测定 三、荧光测量 第六节 流式细胞术在临床检测中的 四、细胞分选原理 主要应用 一、细胞周期和DNA倍体分析 第二节 数据的显示与分析 二、染色体分析 一、参数 三、细胞表面标志的检测 二、数据显示方式 1、淋巴细胞及其亚群的分析 三、设门分析技术 2、淋巴细胞功能分析 3、淋巴造血系统分化抗原及白血 第三节 流式细胞仪技术要求 病免疫分型 一、检测样品制备 四、肿瘤耐药相关蛋白分析 二、常用的荧光染料与标记染色 五、AIDS病检测中的应用 三、胶乳颗粒的应用 六、自身免疫性疾病相关HLA抗原 四、流式细胞技术的质量控制 分析 七、移植免疫中的应用

流式细胞术(flow cytometry, FCM)亦称荧光激活细胞分选器(fluorescence-activated cell sorting, FACS):是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机以及细胞荧

写在课前的话

流式细胞术融合了流体动力学、激光技术、电子工程、计算机技术和单克隆抗体染色技术等多学科的知识，成为一个专门的领域。它不仅应用于细胞生物学、植物学、分子生物学、生物化学、微生物学等理论科学的研究，以及血液学、免疫学、病理学、肿瘤学、遗传学等临床医学的疾病诊断和治疗，而且可以应用于农林畜牧养殖业及环境、食品、药品等检测等，因此学习其原理极其重要。

一、流式细胞术概念 (一) 概念

流式细胞术(Flow Cytometry，FCM):是上世纪70年代的一项高新技术，是利用流式细胞仪对处在快速、直线、流动状态中的单细胞或生物颗粒进行多参数、快速定量分析，同时对特定群体加以分选的现代细胞分析技术。其研究对象为生物颗粒，包括各种动物植物细胞、微生物及人工合成微球等。研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并同时进行定量的一项技术。目前这项技术已广泛应用于生物学和医学的各个领域，已成为细胞学分析领域中不可替代的重要工具。

(二) 流式细胞术的特点

1. 快极短时间内可分析大量细胞，只要标本中的细胞数量足够，流式细胞仪（Flow cytometer）可以每秒钟数十、数百、数千个细胞的速率进行测量，测量的细胞总数可达数千、数万乃至数百万个。

2.

流式细胞术讲义

流式细胞术的血液学应用

北京协和医院血液科 汪 玄

流式细胞术讲义

流式细胞术的概念

流式细胞术(Flow cytometry;FCM)是集计算 机技术、激光技术、电子技术、流体力学、细胞化 学、细胞免疫学等多门高新技术与方法为一体的现 代细胞分析技术，它以流式细胞仪(Flow cytometer)为工具，在单细胞水平上对大量细胞 进行高速(每秒计数可达1000~10000个细胞)、准 确、多参数的定量分析或分选(纯度可达99%以 上),已成为现代骨髓血细胞学研究中最先进的分 析技术。

流式细胞术讲义

流式细胞术与PNH的诊断

流式细胞术讲义

原 理

阵发性睡眠性血红蛋白尿症(PNH)是 一种获得性基因突变所致的克隆性疾病， 其异常的血细胞膜糖化肌醇磷脂-锚 (GPI-anchor)连接蛋白如CD59,CD55 等表达明显减低或缺乏，导致对补体的敏 感性增强而产生溶血性贫血。

流式细胞术讲义

样本要求： EDTA抗凝血或骨髓3ml 每天上午送检

收费：CD55/CD59

CD59

280元 140元

流式细胞术讲义

临床诊断值 CD59阳性的红细胞大于等于95% CD59阳性的中性粒细胞大于90%

流式细胞术讲义

流式细胞术与 白血病免疫分型

蚌埠医学院科研中心

细胞周期/DNA分析（PI法）

一、鞘液准备（至少3L PBS，提前一天准备）

0.01M的PBS配制方法：800ml蒸馏水中溶解NaCl8.0g；KCl0.2g；Na2HPO40.24g；调节pH到7.2-7.4（用HCl或NaOH调节，各地蒸馏水的酸碱度不同），加蒸馏水定容至1L，0.22um滤膜过滤后，室温保存。

二、制备一个阴性对照来设定流式细胞仪的取样参数和十字门的范围：

没有染色的细胞（制备过程如下，仅不加抗体） 三、实验步骤

1.取对数期生长细胞，倒去培养液，胰酶适度消化细胞，用培养液吹打，1000rpm，离心10min弃上清；

2.PBS洗2次，加0.5ml吹匀，务必吹散；

3.加入70%预冷乙醇中（标准做法是将细胞悬液加入预冷70％酒精），固定时可加入Triton X-100以增加膜的通透性）封口膜封口，4℃固定1-2h或过夜（可长至一个月）； 4.1000rpm×10min离心收集细胞，PBS洗两次； 5.用0.4mlPBS重悬细胞并转移至离心管中轻轻吹打；

6.加入Rnase-A约3ul至终浓度50ug/ml，37℃水浴消化30min； 7.加入PI约50ul至终浓度约为5-50ug/ml，室温避光

蚌埠医学院科研中心

细胞周期/DNA分析（PI法）

一、鞘液准备（至少3L PBS，提前一天准备）

0.01M的PBS配制方法：800ml蒸馏水中溶解NaCl8.0g；KCl0.2g；Na2HPO40.24g；调节pH到7.2-7.4（用HCl或NaOH调节，各地蒸馏水的酸碱度不同），加蒸馏水定容至1L，0.22um滤膜过滤后，室温保存。

二、制备一个阴性对照来设定流式细胞仪的取样参数和十字门的范围：

没有染色的细胞（制备过程如下，仅不加抗体） 三、实验步骤

1.取对数期生长细胞，倒去培养液，胰酶适度消化细胞，用培养液吹打，1000rpm，离心10min弃上清；

2.PBS洗2次，加0.5ml吹匀，务必吹散；

3.加入70%预冷乙醇中（标准做法是将细胞悬液加入预冷70％酒精），固定时可加入Triton X-100以增加膜的通透性）封口膜封口，4℃固定1-2h或过夜（可长至一个月）； 4.1000rpm×10min离心收集细胞，PBS洗两次； 5.用0.4mlPBS重悬细胞并转移至离心管中轻轻吹打；

6.加入Rnase-A约3ul至终浓度50ug/ml，37℃水浴消化30min； 7.加入PI约50ul至终浓度约为5-50ug/ml，室温避光

流式细胞术

一. 流式细胞术概述

流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是七十年代发展起来的高科学技术,?它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体, 同时具有分析和分选细胞功能。它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等,可对群体细胞在单细胞水平上进行分析, 在短时间内检测分析大量细胞,并收集、储存和处理数据,进行多参数定量分析; 能够分类收集(分选)某一亚群细胞,分选纯度＞95%。在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。

国内使用的流式细胞仪主要由美国的两个厂家生产:BECKMAN- COULTER公司和Becton-Dickinson公司(简称B-D公司)。流式细胞仪主要有两型:临床型（又称小型机、台式机）和综合型（又称大型机、分析型）。BECKMAN-COULTER公司最新产品为EPICS ALTRA和EPICS XL/XL-MCL, B-D?公司最新产品为FACS Vantage和FACS Calibur。EPICS XL/XL-MCL和FACS Calibur是临床型;EPICS ALTRA和 FACS Vanta

第一章流式细胞仪的结构和原理

第1节流式细胞术发展史

纵观历史，几乎没有哪一门科学技术象流式细胞术这样凝结了众多不同学术背景、不同科研领域科学家的心血。从流式细胞术的发明、改进、革新，到今天在各个领域应用的拓展，每一步都是诸如生物学、生物技术、计算机科学、流体力学、激光技术、高等数学、临床医学、分子生物学、有机化学和生物物理学等学科知识综合运用的结晶。现代流式细胞术更是由于结合了单克隆抗体技术、定量细胞化学技术和定量荧光细胞化学，使其在生物学、临床医学、药物学等等众多研究领域中的应用有了更加突飞猛进的发展。临床流式细胞术发展趋势可归纳为：①流式细胞仪从单纯大型仪器发展为适应各种实际应用的便携式、台式、高分辨率、高质量分选的研究型流式细胞仪；②对流式细胞术检测荧光参数，从采用荧光单色、双色分析发展为多色分析，目前最多可同时检测15 种荧光信号；③从检测参数的相对定量发展为绝对定量；④从检测参数的手动人工分析发展为计算机软件的自动分析；⑤所采用的荧光试剂，从非配套试剂发展为配套的试剂盒试剂。而这一切，就要求我们流式细胞仪使用者和科研人员一定要不断地有意识地学习上述各门学科知识，只有这样才能更好地将流式细胞术应用到生物医学的临床实践和基础科学研究工作中

流式细胞术

一. 流式细胞术概述

流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是七十年代发展起来的高科学技术,?它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体, 同时具有分析和分选细胞功能。它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等,可对群体细胞在单细胞水平上进行分析, 在短时间内检测分析大量细胞,并收集、储存和处理数据,进行多参数定量分析; 能够分类收集(分选)某一亚群细胞,分选纯度＞95%。在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。

国内使用的流式细胞仪主要由美国的两个厂家生产:BECKMAN- COULTER公司和Becton-Dickinson公司(简称B-D公司)。流式细胞仪主要有两型:临床型（又称小型机、台式机）和综合型（又称大型机、分析型）。BECKMAN-COULTER公司最新产品为EPICS ALTRA和EPICS XL/XL-MCL, B-D?公司最新产品为FACS Vantage和FACS Calibur。EPICS XL/XL-MCL和FACS Calibur是临床型;EPICS ALTRA和 FACS Vanta

一. 流式细胞术概述

流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是七十年代发展起来的高科学技术,它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体, 同时具有分析和分选细胞功能。它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等,可对群体细胞在单细胞水平上进行分析, 在短时间内检测分析大量细胞,并收集、储存和处理数据,进行多参数定量分析; 能够分类收集(分选)某一亚群细胞,分选纯度＞95%。在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。

国内使用的流式细胞仪主要由美国BECKMAN- COULTER公司和

Becton-Dickinson公司(简称B-D公司)两个厂家生产。流式细胞仪主要有两型:临床型（又称小型机、台式机）和综合型（又称大型机、分析型）。BECKMAN-COULTER公司最新产品为EPICS ALTRA和EPICS XL/XL-MCL,BD公司最新产品为FACS Vantage 和FACS Calibur。EPICS XL/XL-MCL和FACS Calibur是临床型;EPICS ALTRA和 FACS Vantage是综合型，除具备检测分析功能

仪器名称：流式细胞仪

生产厂家：美国贝克曼库尔特有限公司 使用方法：一．开机程序

1．检查稳压器电源，打开电源，稳定5分钟。

2．打开储液箱，倒掉废液, 并在废液桶中加入400ml漂白水原液。打开压力阀，取出鞘液桶，将鞘液桶加至4/5满（一般可用三蒸水，做分选必须用PBS或FACSFlow），合上压力阀。确实盖紧桶盖，检查所有管路是否妥善安置。

3．将FACSCalibur开关打开，此时仪器功能控制钮的显示应是STANDBY，预热5－10分钟。排出过滤器内的气泡。

4．如果需要打印，打开打印机电源。

5．打开电脑,等待屏幕显示出标准的苹果标志。

6．执行仪器PRIME功能一次，以排除Flow cell中的气泡。 7．分析样品时，先用FACAFlow 或PBS进行HIGH RUN约2分钟。

? 做过分选后，每次开机后需冲洗管道：向分选装置上装上两个50ml离心管，不接通浓缩系统，摁下右下角白色按钮开始冲洗。待自动停止后接通浓缩装置，同上法冲洗一次。

二．预设获取模式文件(Acquisition Template Files)

1．从苹果标志中选择CELLQuest见一个新视窗，可利用此视窗编辑一个获取模式文件。

2．选取屏幕左列绘图工具中的Do