拟南芥cas9突变体筛选

本科生文献综述

题 目

拟南芥突变体的筛选综述

系 别

林学与园艺学院

班 级

姓 名

园艺102班

唐辉

学 号 103231228

答辩时间 年 月

新疆农业大学 林园 学院

拟南芥突变体的筛选综述

唐辉 指导老师：王燕凌

摘要：本文归纳了拟南芥抗旱、抗氧化、耐低钾、耐硒、耐盐、晚花突变体筛选的研究内容。在拟南芥抗旱突变体筛选中将用到甘露醇模拟干旱胁迫来进行试验。在抗氧化、耐低钾、耐硒中将用到Na2SeO3、钾、硒、NaCl等化合物或者化学元素对拟南芥突变体的生长发育影响来进行拟南芥突变体的筛选。概括了拟南芥突变体在甘露醇模拟干旱中的生长影响以及

RMD水稻突变体信息及基因型鉴定

1. 背景介绍：

突变体对于遗传学研究有着重要作用，随着拟南芥和水稻等物种全基因组测序的开展，人类积累了前所未有的基因序列信息，为了弄清这些基因序列的生物学信息，寻找该基因区段序列发生变异的突变体是阐释基因功能最直接最有效的方法。

植物在自然的环境条件下也会产生突变性状，早期普通正向遗传学研究往往通过寻找与某种生物学特性相关的突变体来发掘或定位某个特定基因。为配合植物功能基因组研究高通量的策略，构建水稻等物种的大型突变体库已成为必然，借助水稻全基因组测序信息、通过反向遗传学的手段大规模地筛选突变体库，理论上可以获得基因组中任一基因的突变体，最终实现阐释基因功能的目的。

2. 原理：

2.1农杆菌介导的T-DNA 插入

农杆菌是寄主范围非常广泛的土壤杆菌，它能通过伤口侵染植物导致冠瘿瘤 和毛状根的发生。1974从根癌农杆菌中分离出一种与肿瘤诱导相关的质粒，称为致瘤质粒（Tumor-inducing plasmid），简称Ti 质粒。Ti 质粒上存在一段DNA，能够转移并整合到植物基因组中，称为Transferred DNA，简称T-DNA。 研究发现，T-DNA 两端存在非常保守的同向重复的25bp 序列，

作物学报,农作物,期刊,一级学报

作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2011, 37(4): 629 634

ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9

/zwxb/

E-mail: xbzw@

DOI: 10.3724/SP.J.1006.2011.00629

水稻颖壳和浆片异常突变体ahl的基因定位

王 增 李云峰** 马 娇 任德勇 王德仲 游小庆 桑贤春 何光华*

西南大学水稻研究所 / 转基因植物与安全控制重庆市重点实验室, 重庆400716

摘 要: 研究水稻花发育基因对于水稻相关性状的分子育种具有十分重要的意义。本研究报道了一个水稻颖壳和浆片异常突变体ahl (abnormal hull and lodicule), 来源于优良恢复系缙恢10号的EMS诱变群体。该突变体内外稃变小并发生严重扭曲, 浆片顶端伸长。内外稃异常导致灌浆后米粒变小、畸形, 千粒重下降。该性状遗传稳定, 受1对隐性基因控制, 利用群体分离分析法 (bulked segregation analysis, BSA)将AHL基因定位在第2染色体上的SSR标记RM14153与RM14167之间, 遗传

利用不同理化条件诱变获得果蝇突变体的研究

赵 颖，马志红，赵航渊，马雅钦，李承贤，赵宝存，齐志广

（河北师范大学 生命科学学院，河北 石家庄 050024）

摘 要：以野生型黑腹果蝇和白眼突变体为材料，采用紫外线、热激和EMS的方法分别在幼虫、蛹、成虫等发育阶段进行诱变处理，结果表明，紫外线照射白眼果蝇的蛹2h，可使羽化当代出现无翅果蝇，其子二代可出现纯合致死的残翅突变型和可遗传的双焦翅突变型；而紫外线照射成蝇虽使果蝇有突变体出现，但突变体要么死亡要么其后代性状恢复正常。热激白眼果蝇幼虫2h可引起遗传突变，并能得到稳定遗传的突变体，4h、8h可引起不能稳定遗传的突变；热激果蝇蛹和成蝇也能引起遗传突变。用含0.5%EMS的培养基培养对果蝇雌蝇的卵细胞影响较大，其后代的突变体较多，而对雄蝇的精子影响则相对较小，后代几乎没有突变体出现。

关键词：果蝇 紫外线 热激 EMS 突变体

The research of fruit flies’ mutants which are produced by different physical and chemical methods

ZHAO Ying，MA Zhihong，ZHAO Han

中国农业科学 2010,43(2):223-229 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2010.02.001

两个新的水稻叶色突变体形态结构与遗传定位研究

1

2

1

2

1

2

1

2

1

张力科，李志彬，刘海燕，李如海，陈满元，陈爱国，钱益亮，华泽田， 高用明，

11,3

朱苓华，黎志康

（1中国农业科学院作物科学研究所，北京 100081；2辽宁省稻作研究所，沈阳 110101；3 International Rice Research Institute, DAPO Box7777,

Metro Manila, Philippines）

摘要：【目的】对2个新的水稻叶色突变体进行形态结构与遗传分析，并且初步定位这2个突变基因。【方法】在水稻育种材料中分别发现了一株白色条纹叶突变体和一株黄叶突变体，经多代自交已形成稳定的突变系。对突变体的主要形态特征与叶绿素组分等进行分析，观察叶绿体的超微结构，并以这2个突变系杂交产生的F2群体作为定位群体，应用SSR标记对突变基因进行初定位。【结果】与

农药学学报　2008,10(3):3032310

C h inese J ourna l of Pesticide Science

?研究论文?

番茄叶霉病菌异菌脲抗药性突变

体的诱导与生物学性状

张传清31,2,　马忠华2,　朱国念2

(1.浙江林学院农业与食品科学学院,杭州311300;2.浙江大学农业与生物技术学院,杭州310029)

摘　要:测定了苯并咪唑类杀菌剂敏感2乙霉威抗性(B en S2D ie R)、苯并咪唑类杀菌剂抗性2乙霉威敏感(B en R2D ie S)和苯并咪唑类杀菌剂抗性2乙霉威抗性(B en R2D ie R)3种类型的番茄叶霉病菌

C ladospo rium fulvum菌株对不同类型药剂的敏感性。结果表明,蕃茄叶霉病菌对供试药剂的敏感

性与其对苯并咪唑类杀菌剂及乙霉威的敏感性无关。根据药剂对3类菌株EC

值的平均值,

50 16种杀菌剂抑制菌丝生长的活性依次为腐霉利>乙烯菌核利>异菌脲>戊唑醇>百菌清>嘧霉胺>醚菌酯>代森锰锌>82羟基喹啉铜>丙环唑>苯醚甲环唑>嘧菌酯>灭锈胺>烯酰吗啉>烟酰胺>三唑酮;抑制孢子萌发的活性依次为醚菌酯>腐霉利>百菌清>乙烯菌核利>灭锈胺>82羟基喹啉铜>异菌脲>代森锰锌>嘧菌酯>烟酰胺>嘧霉胺

植物生理学报 Plant Physiology Journal 2015, 51 (9): 1351~1358　　doi: 10.13592/j.cnki.ppj.2015.01761351

综　述 ReviewsCRISPR/Cas9基因组编辑技术在植物基因功能研究及植物改良中的应用

曾秀英1, 侯学文1,2,*

华南农业大学生命科学学院1植物逆境生物学研究中心; 2广东省植物功能基因组与生物技术重点实验室, 广州510642摘要: CRISPR/Cas是发现于细菌和古细菌基因组中的特殊结构, 参与细菌和古细菌破坏噬菌体和外源质粒的免疫保护。科学家将II型CRISPR/Cas改造成为一个组装简便、高效和精准的基因组编辑工具, 并迅速在动物、植物和微生物基因功能研究和遗传改造中获得广泛应用。本文介绍CRISPR/Cas9技术出现近两年来, 在水稻、小麦、高粱、拟南芥、烟草、甜橙等植物中的研究情况, 在此基础上对该技术的优点和需要进一步改进的地方提出了看法。

关键词: 成簇的、规律间隔的短回文重复序列; 成簇的、规律间隔的短回文重复序列相关核酸酶9; 基因组编辑技术; 植物基因功能; 植物改良

Application of CRISPR/Cas9

一、材料试剂准备

1） 质粒：

pSpCas9(BB)-2A-GFP (Addgene plasmid ID: 48138)，用于转染cas9，该质粒含有Cas9与GFP，Cas9的nickase活性将用于特定目的基因的ko，GFP可做为转染标签。

pSpCas9(BB) (Addgene plasmid ID: 42230)，若实验用sgRNA为PCR扩增纯化产物，则需要该质粒做为U6的模版。

pUC19(Invitrogen, cat.no.15364-011)可用于构建sgRNA，若用PCR产物进行转染，则需要该质粒来进行共转染，做为DNA carrier。

上述三种质粒，根据实验选择sgRNA的表达方式（PCR产物/ 单载体系统/ 双载体系统）来确定具体使用哪种。

2） 超纯水，DNase/RNase-free (Life Technologies, cat. no. 10977-023)

3） 高保真聚合酶，Kapa HiFi (Kapa Biosystems), PfuUltra (Agilen)，Herculase II fusion polymerase 均可，只需保真效果好，扩增过程不产生突变。

4） Taq DNA

CRISPR/Cas9系统的发现历史和应用-@华夏凯奇

【CRISPR/Cas9系统的发现历史和应用-@华夏凯奇】

-兼谈八卦。水平有限，不准确和班门弄斧之处，还望大家斧正。

一、CRISPR系统的发现-从细菌的获得性免疫说起

CRISPR系统实际是细菌的一种获得性免疫系统。细菌被phage侵染之后，可以获得phage的DNA片段整合进基因组形成记忆，当再次遭到入侵时，从对phage形成免疫。

1） 早在1987年，日本人在大肠杆菌中发现有串联间隔重复序列。但一直不清楚功能。后来的研究发现，这种重复序列广泛存在于细菌和古细菌中。2002年才正式命名为CRISPR(Clustered regulatory interspaced short palindromic repeats).

2） 随着测序技术和生物信息学的发展，2005年，三个研究组同时发现间隔序列（图中红

色箭头所示）和侵染细菌的病毒或phage高度同源。从而推测，这一系统可能是类似于siRNA一样，是细菌抵抗Phage的一种机理。

（这些和植物的siRNA, 高等动物的获得性免疫一样，都是获取入侵病毒的一个片段形成记忆，从而再次遭到入侵时可以对抗入侵的一种方式）

这中间还有很

Genloci Classic CRISPR-Cas9内部操作流程

未来的中国科学家们，加油！ Genloci Classic CRISPR-Cas9内

部操作流程

Protocol No. PT140726-1

Genloci Classic CRISPR-Cas9内部操作流程

1，CRISPR-Cas9基因编辑实验流程图如下：

1 ～20bp

-3’ - CACC G 5’

-5- CAAA ’ 3’

设计2条单链oligo序列；退 火形成双链DNA。

2 将双链 DNA连接到载体中。

3 转化 G10 Competent Cell；筛 选阳性克隆；测序验证序列； 质粒大提；电转染靶细胞。

4 在细胞内 crRNA识别靶位点， Cas9对靶位点进行随机剪切。

5

CruiserTM酶切细胞池，计算突变 率；CruiserTM酶切初筛阳性克隆； 将阳性克隆测序验证；做敲除序列比对分析。