农杆菌介导的基因转化

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以55个大豆基因型未成熟子叶为外植体,用高浓度2,4-D诱导大豆体细胞胚胎发生与植株再生,并对生产上种植面积大、体细胞胚胎发生率高的大豆基因型用农杆菌介导法进行遗传转化。结果表明,东北地区主栽的大豆基因型中有14个基因型体细胞胚胎发生率超过40%。用含有pGBI121S4ABC

遗!传!!"#"#"$%&’(!)*++-!"#"$#!%&&$!&&’,."

研究报告

大豆体细胞胚胎发生与农杆菌介导的遗传转化

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王!萍*!!王!罡!!!季!静!!!曾凡亭(!黄彬城(!曹!江(!吴!颖(

!哈尔滨*天津(*O黑龙江省农业科学院博士后工作站$#&&+")!O天津大学农业与生物工程学院$&&&%!)

长春*"(O解放军军需大学植物基因工程研究中心植物分子生物学研究室$(&&"!

摘!要!以#用高浓度!$并对生#个大豆基因型未成熟子叶为外植体$’-P诱导大豆体细胞胚胎发生与植株再生$产上种植面积大*体细胞胚胎发生率高的大豆基因型用农杆菌介导法进行遗传转化(结果表明$东北地区主栽的

农杆菌感受态制备

1、划平板，单克隆培养

2、挑单克隆于5ML LB培养基中，摇到饱和（1-2day） 3、50m离心管中4500rpm，15min

4、50ml菌体用1ml氯化钙（预冷）悬浮，冰上操作 5、每100ul分装于冷冻管中，液氮速冻后，-70℃保存

农杆菌转化

1．50ul感受态+5ul质粒，放入液氮速冻2min 2．37℃ 热激5min

3. 加1mlLB，28℃培养3-4h

3. 8000rpm/min去上清，200ulLB悬浮，涂板吹干 农杆菌抗性：利福平+庆大霉素+载体抗性。（GV3101） 庆大霉素 40mg/ml （0.4g/10ml）；利福平 50mg/ml DMSO溶解 200ml LB + 200ul母液

农杆菌转植物

1. 植物去顶三天后转化，转前一天交足水

2. 摇菌OD600=1.2~1.6 （先小摇后，取200ul大摇200ml）

3. 室温5000rpm，15min，弃上清，悬浮于等体积渗透培养基中 （200ml/转化） 每1000ml渗透培养基：1/2 MS 2.42g；蔗糖50g；MES 0.5g；用1M KOH调PH到5.8/5.7，定容到1000ml，加10ul 1mg/ml6-BA，加200

13（5）：789-797植物遗传资源学报2012，

JournalofPlantGeneticResources

农杆菌介导的大豆子叶节非组织

培养遗传转化体系优化

李丹丹，张

洁，刘

娜，陈

琰，韩胜芳，王冬梅

（河北农业大学生命科学学院，保定071001）

摘要：本研究以GUS基因在子叶节区的瞬时表达为依据，通过探讨影响农杆菌转化效率的因素，优化了大豆子叶节非组织培养遗传转化体系；利用该体系对冀豆16号进行Bar基因的遗传转化，并使用针刺法对转基因植株进行草铵膦筛选。结果OD600=0.6、77、表明，侵染液中附加3%蔗糖、以脱脂棉作为菌液附着介质同时不添加表面活性剂SilwetL-侵染1次的GUS阳PCR鉴定共获转化率为2.5%。经PCR和RT-性率最高达到62.13%。草铵膦抗性植株经PCR检测获得T0阳性植株10个，得3株T1阳性植株，初步证明目的基因已整合到大豆基因组中。

关键词：大豆；子叶节；非组织培养；遗传转化；草铵膦筛选

OptimizationoftheAgrobacterium-MediatedGeneticTransformation

SystemofSoybeanCotyledonaryNodeWithNonTissue-Culture

感受态制备

A 大肠杆菌感受态的制备（CaCl2法）（《水稻NR和NIR基因启动子的克隆及功能验证》第38页）

1 材料、设备及试剂

1.1 材料

大肠杆菌DH5α、BL21、Rossette、JM109菌株

1.2试剂

LB液体培养基：

蛋白胨 10g/L

酵母提取物 5g/L

NaCl 10g/L

NaOH（1mol/L） 1mL/L

400mL 0.1M/L预冷的 CaCl2溶液（高温高压灭菌）

50%甘油

75%酒精

95%酒精

液氮

1.3 实验设备

接种环、酒精灯，打火机，75%酒精，95%酒精，50mL灭菌三角瓶4个，250mL灭菌的三角瓶4个，移液抢（5mL、200μL，1000μL），灭菌的枪头（5mL、200μL，1000μL），离心管（1.5mL，50mL）恒温摇床,灭菌锅，紫外分光光度计，超净工作台，制冰机，冰盒，高速冷冻离心机。

2 实验步骤

1、从新鲜培养的大肠杆菌DH5α平板上挑取一个单菌落，接种于5mL新鲜LB培液体养基中，于37℃，200rpm振荡培养过夜。

2、培养1

感受态制备

A 大肠杆菌感受态的制备（CaCl2法）（《水稻NR和NIR基因启动子的克隆及功能验证》第38页）

1 材料、设备及试剂

1.1 材料

大肠杆菌DH5α、BL21、Rossette、JM109菌株

1.2试剂

LB液体培养基：

蛋白胨 10g/L

酵母提取物 5g/L

NaCl 10g/L

NaOH（1mol/L） 1mL/L

400mL 0.1M/L预冷的 CaCl2溶液（高温高压灭菌）

50%甘油

75%酒精

95%酒精

液氮

1.3 实验设备

接种环、酒精灯，打火机，75%酒精，95%酒精，50mL灭菌三角瓶4个，250mL灭菌的三角瓶4个，移液抢（5mL、200μL，1000μL），灭菌的枪头（5mL、200μL，1000μL），离心管（1.5mL，50mL）恒温摇床,灭菌锅，紫外分光光度计，超净工作台，制冰机，冰盒，高速冷冻离心机。

2 实验步骤

1、从新鲜培养的大肠杆菌DH5α平板上挑取一个单菌落，接种于5mL新鲜LB培液体养基中，于37℃，200rpm振荡培养过夜。

2、培养1

研究进展

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２００９，ｖｏｌ４３Ｎｏ

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２７５

幽门螺杆菌毒力基因与胃癌的研究进展

林妙端（综述），余菲菲（审校）

关键词：

螺杆菌．幽门；胃肿瘤；毒力；基因，细菌

中图分类号：Ｒ７３５．３０３；Ｒ３７７文献标识码：Ａ

幽门螺杆菌（Ｈｅｌｉｃｏｂａｃｔｅｒｐｙｌｏｒｉ，Ｈｐ）是引起萎缩性胃炎和胃溃疡等慢性炎症的致病因子．流行病学和动物实验证实，Ｈ户慢性感染是导致胃癌的重要危险因素，１９９４年世界卫生组织已将其列为ｌ类致癌原［１］。Ｈｐ感染机体后在临床上所表现出的不同结局除与宿主和环境因素有关外，还与Ｈｐ菌株的异质性．即基因组的高度多态性有关，尤其是毒力基因的异质性．决定Ｈｐ感染后是否导致炎症、溃疡乃至胃癌的发生。Ｈｐ确切的致癌机制尚不清楚，大量研究表明：ｃａｇＡ与ｖａｃＡ基因分别是发生胃癌的高危险因子［２］。随后陆续发现ｉｃｅＡ、ｏｉｐＡ、ｂａｂＡ等基因与胃癌的发生密切相关，但这些基因无一单独可作为疾病特异性的标志。随着比较基因组学和功能基因组研究的开展。人们开始将寻找Ｈｐ致病特异基因（尤其是与致癌相关的基因）的目标投向其“可

塑区”（ｐｌａｓｔｉｃｉｔｙｒｅｇｉｏｎ）。笔者现就与胃癌相关的Ｈ户毒力

基因在胃癌形

通过目标基因内部缺失片段的获得以及DNA重组交换等技术的有效运用,在氨基酸工业重要生产菌谷氨酸棒杆菌中,成功地定点构建了两个目标研究基因的单基因缺失菌株和双基因缺失菌株,并通过了PCR和测序等方法的分析验证。??

!"卷!期"##"年$月微生物学报!"#$%&"’()&(*(+&"$,&-&"$%&’(!")*+*,-.&(!"##"

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谷氨酸棒杆菌基因缺失菌株的定点构建

阮红04567896:;<=>977,"

（0浙江大学生命科学学院

杭州

?0##"@）德国）

（"A’>大学微生物与生物技术学系

摘要：通过目标基因内部缺失片段的获得以及/.)重组交换等技术的有效运用，在氨基酸

工业重要生产菌谷氨酸棒杆菌中，成功地定点构建了两个目标研究基因的单基因缺失菌株和双基因缺失菌株，并通过了BCD和测序等方法的分析验证。关键词：谷氨酸棒状杆菌，基因缺失，/.)重组。

大肠杆菌基因型和参考文献

Cloning & Expression

Genotypes of Selected E. coli Strains

Genotypes of Selected E. coli Strains

BL21 E. coli B F– ompT gal [E. coli B is naturally dcm and lon] hsdSB

BL21(DE3) E. coli B F– ompT gal [E. coli B is naturally dcm and lon] hsdSB with DE3, a λ prophage carrying the T7 RNA polymerase gene and lacIQ

C600 F– [e14– (McrF–) or e14+ (McrF+)] thr-1 leuB6 thi-1 lacY1 glnV44 rfbD1 fhuA21

CJ236 F Δ(HindIII)::cat (Tra+ Pil+ CamR )/ ung-1 relA1 dut-1 thi-1 spoT1 mcrA

GC5 F´ endA1 hsdR17 (rK–mK+) glnV44 thi-1 r

EHA101农杆菌感受态细胞 编码 北京华越洋生物WXR15-100S 北京华越洋生物WWXR115-100 产名称 EHA101农杆菌感受态细胞 EHA101农杆菌感受态细胞 单位 规格 盒 盒 10*100ul 20*100ul

EHA101农杆菌感受态细胞

EHA101 Chemically Competent Cell 产品说明书 产品规格

EHA101: 10×100 μl

pK7WGF2 (control vector) 10 ng/μl 10 μl

保存条件： -80℃ 基因型

C58 (rif R) Ti pEHA101 (pTiBo542 D T-DNA) (kanR, strepR) Nopaline

EHA101农杆菌感受态细胞说明

华越洋 EHA101菌株为C58型背景，核基因中含有筛选标签——利福平抗性基因rif，为了便于转化操作，此菌株携带一无自身转运功能的胭脂碱型Ti质粒pEHA101 (pTiBo542DT-DNA)，此质粒含有vir基因 (vir基因是T-DNA插入植物基因组必需的元件，pEHA101