重组质粒转化失败的原因

重组质粒的转化

重组质粒的转化(热休克法)

本方案不仅适合于转化连接体系，同样适合于转化已有的质粒（一般1~2μl质粒即可）。 本流程以α-互补鉴定为例。适用于含有?-半乳糖苷酶基因(LacZ)的载体（如T载体），载体含有LacZ的调控序列和头146个氨基酸的编码信息。不能使用α-互补鉴定的载体可以使用含相应抗生素的平板鉴定（即直接使用LB/Amp或LB/Kana等，不用加IPTG/X-Gal）。

㈠试剂及材料:

1. IPTG溶液(异丙基硫代-?-D-半乳糖苷，200mg/ml): 2g IPTG溶于8ml双蒸去离子水中，用双蒸去离子水调节体积至10ml，0.22um滤器过滤除菌，分装1ml/管，-20℃保存。 2. X-Gal(5-溴-4氯-3吲哚-?-D-半乳糖苷):已购入，铝箔纸包裹避光，-20℃保存。 3. LB液体培养基（无抗生素）。

4. 含有ampicillin/IPTG/X-Gal的LB培养板（LB/Amp/IPTG/X-Gal）: 在含有ampicillin的LB培养板表面加入4μl 200mg/ml IPTG和16μl 50mg/ml X-Gal，用无菌玻璃涂布器均匀涂布平板表面，37℃×30min可完全吸收，即可使用。

重组质粒的构建、转化、筛选和鉴定

实验目的：

1. 学习在实现DNA体外重组过程中，正确选择合适的载体和限制性内切酶并能对限制性核

酸内切酶对载体和目的DNA进行切割，产生利于连接的合适末端。

2. 学习设计构建重组DNA分子的基本方法，掌握载体和外源目的DNA酶切的操作。 3. 学习利用T4DNA连接酶把酶切后的载体片段和外源目的DNA片段连接起来，构建体外DNA

分子的技术，了解并掌握几种常用的连接方式。 4. 掌握利用Cacl2 感受态细胞的方法。

5. 学习掌握热击法转化E.coli的原理和方法。

6. 掌握α互补筛选法和PCR检测法筛选重组子的方法。并鉴定体外导入目的DNA片段的大

小。

7. 学习和掌握PCR反应的基本原理和操作技术，了解引物设计的基本要求。

实验原理：

外源DNA与载体分子的连接即为DNA重组技术，这样重新组合的DNA分子叫做重组子。重组的DNA分子式在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经限制性内切酶酶切的载体分子和外源DNA分子连接起来。将重组质粒导入感受态细胞中，将转化后的细胞在选择性培养基中培养，可以通过α互补筛选法筛选出重组子，并可通过酶切电泳及PCR检验的方法进行重组子的

DNA的酶切、连接、转化和重组子的筛选与鉴定

摘要

本实验通为了验证重组质粒的类型，进行了如下实验：PUC19的单酶切、连接、转化、重组子的筛选与鉴定、转化子的菌落PCR、平板复证、琼脂糖凝胶电泳等。所用的酶有Hind Ⅲ核酸内切酶，T4连接酶和Taq酶。由于Hind Ⅲ单酶切质粒产生的片段多样，需要通过一系列的筛选、副证与电泳鉴定来最终确定酶切片段的类型。

关键字 酶切 连接 转化 重组子琼脂糖凝胶电泳

引言

重组DNA技术是指将一种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体）内，使之按照人们的意愿稳定遗传并表达出新产物或新性状的DNA体外操作程序，也称为分子克隆技术。因此，供体、受体、载体是重组DNA技术的三大基本元件。本实验的供体是λ DNA，受体是E.coliDH5α,载体是PUC19。

DNA的酶切通常是DNA重组技术的第一步，酶切是指将不同来源的DNA上将待克隆的DNA片段特异性切下，同时在载体DNA分子（一般为质粒DNA）上打开相应的缺口，然后将两者连接成重组DNA分子。这一特异性的切割过程常由特定的限制性核酸内切酶来完成。目前在细菌中发现有600多种限制性核酸内切酶，根据其性质的不同可分为三大类

-------------------以下是 人们失败的主要原因

人生的最大悲剧，就是孜孜不倦的努力却终于失败！

美国一位学者曾经分析了数千人的经历，结果是总人数的98%都是失败者。并由此归纳了人们失败的主要原因，有31种之多。当你逐项阅读它们时，要一一检查自己，以求发现将你排斥在成功之外的有多少种。

1、不利的遗传背景：对于生来就脑力不足的人，好主意是不会多的。有一个可用来弥补这种缺点的方法，就是组织个智囊团，求得别人的帮助。不过请注意，在所有31中失败因素中，只有这一种是任何人难以改变的。

2、缺乏明确的生活意向：没有中心意向或明确目标而盲目

努力的人是毫无希望的。

3、缺乏中等以上目标的雄心：对于人生漠然、不求上进的人，我们是不存什么奢望的，对于不愿已付出代价的人，也不过如此。

4、教育不充足：这是比较易于改善的。经验证明，最有教养的人，往往是自我造就或自我教育的人。要成为有教养的人，所需要的不仅仅是大学的学位，更要学会能取得生活所需的一切，但又不损害旁人的权利。再有，教育不止包含很多的一般知识，还要包含那些有效又能持久运用的特殊知识。人们并不为他们所懂得的知识付出金钱，而是为了他们用知识去创

红军西征失败的原因

在红二、四方面军过草地、出甘南的同时，红一方面军也组成了西方野战军，准备打宁夏战役，夺取宁夏，作为立足之地。

一、当时的态势

红二、四方面军在最南边一线，往北依次是国民党胡宗南、王均的部队、西方野战军、东北军的何柱国、毛炳文部队。

所以，当时中央和军委的想法是：

集中三个方面军主力，以红一方面军为主攻，红二、四方面军配合。歼灭胡宗南的一个师左右，打开北上的通道。

这样，红军就可以有两个选择： ①合兵北上。

②红一方面军夺取宁夏。红四方面军夺取青海、甘肃的河西走廊一带。红二方面军则居中响应支援。

彭德怀主持制订了准备歼灭胡宗南一个师的作战计划。以实现中央的战略意图。

但是，这时的张国焘，在是否北上与中央汇合问题上，再次动摇。无意配合这个作战计划。

在红四方面军中的朱德，坚决支持中央的计划。但是，张国焘不同意。朱德最后只好独自向中央发电：“如果红四方面军，不按中央计划北进，那么造成的后果，他不能负责。”

如果，张国焘要是全力配合，应该命令红四方面军、红二方面军迅速北上，准备配合红一方面军作战。

但是，张国焘不仅没有下令继续北进，反而突然下令红四方面军主力后撤。准备继续与中央讨价还价。等到张国焘与中央电报往来了几天之后，战机已失

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新手烘焙失败的原因

新手为什么会烘焙失败？烘焙粉们看了这么多食谱，会发现烘焙食谱的配料都极其精确，每一种材料都要按照配方准备好，尤其是新手们，只有精确配好材料才能进行下一步工作。

高能预警

你可能会问，每份材料一定要称量得很精确吗？ 好吧，那我们就来瞧瞧，不精确称量材料酿成过的惨剧！

有这样的

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也有这样的

所以，这个到底是杯子蛋糕还是盘子蛋糕？

看完这些，你应该可以领悟到，面粉、鸡蛋、牛奶、黄油和糖，仅仅这几样常见的烘焙材料就构成了品种繁多的烘焙品种，这全靠不同的材料配比和操作过程来实现，所以精准无误的称量是整个烘焙制作的最基础要素。

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试题：

辛亥革命失败的原因有哪些？

答案：

辛亥革命失败的原因

（1）领导革命的资产阶级在理论上没有提出彻底的反帝反封建纲领，在行动上不愿也不敢正面反对帝国主义和彻底推翻封建势力。在思想上识别不清真正的朋友和真正的敌人。

（3）不能建立坚强的革命政党，作为团结一切革命力量的强有力的核心。

【相关阅读】

辛亥革命失败的重要原因分析及启示

辛亥革命是中国历史上的重要转折点，它推翻了中国两千多年的封建君主专制制度，促进了中国的现代化进程。但辛亥革命并没有真正改变中国深层的社会结构，随着革命果实被袁世凯窃取，中国进入了黑暗的北洋军阀统治时期。一般认为辛亥革命的失败是因为没有提出彻底的反帝反封建的革命纲领，不能充分发动和依靠人民群众，不能建立坚强的革命政党作为团结一切革命力量的强有力的核心等。笔者认为这些认识不够深刻，在导致辛亥革命失败的这些原因背后有一个重要的原因，那就是革命党人缺乏正确的群众观，没有走群众路线。

一、辛亥革命没有提出彻底的反帝反封革命纲领之原因分析

辛亥革命没有提出彻底的反帝反封的革命纲领，是因为没有从人民群众对社会变革的要

《维新运动失败的原因》教案

一、目标及要求

1、通过对维新运动的讲义让同学更客观认识戊戌变法失败的原因，学会从多种角度考虑问题。

2、在维新运动失败的原因中总结历史教训，增强历史使命感。 二、教学过程

由几张维新运动的图片导入本课， 维新运动失败原因的几种不同观点：

1、维新变法触及了封建统治阶级中顽固派的利益

实际上，维新的领导人基本上是一批缺乏政治斗争经验的书生，他们大多饱读诗书，忧国忧民，学问渊博，具有政治热情抱负，却缺少谋略和政治经验及才干。

维新派在对传统的封建君主专制旧体制所进行的改革，触动了封建守旧势力的根基，遭到了以那拉氏为首的封建旧势力的顽强抵抗，使变法改革在封建的泥沼中，举步维艰，难以行进。封建顽固守旧势力这时统统聚集在一起，对维新派的改革屡加抵制和破坏。结果，光绪帝被囚禁，康有为、梁启超匆忙出逃，谭嗣同等六君子被杀戮。维新派苦心筹划和设计的一系列关于推行变法、改革国家机构的方案均被吊销。

与此同时，传统的封建君主专制的衙门机构全数恢复。顽固派迫不及待地复置了“皇上所裁詹事府等衙门及各省冗员”，“罢经济特科，废官报局，禁报馆，复八股考试”，接着又恢复了被裁的广东、

湖北、云南三省的巡抚。随着旧机构的恢复，封建的旧官僚们

重组质粒的酶切和PCR验证

姓名：郑小煜

学号：201100140069 班级：11级生物技术班 同组者：赵莉、高瑞

【实验目的】

1、 检验重组质粒的插入片段的大小

2、 学习和掌握PCR反应的基本原理和实验技术。

【实验原理】

（一） 重组质粒酶切鉴定

将含有外源DNA的转化子的E.coliDH5α菌株进行培养，并用试剂盒提取其质粒DNA，将所提取的DNA用切pUC19质粒的同一种限制性内切酶进行切割以验证所插入的外源DNA的大小。 （二） 引物设计

1、引物

体内，引物是一段与模板DNA互补的RNA单链

体外PCR反应中，引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，分别与靶DNA模板的两端互补，从而界定了产物的范围

引物能否与靶DNA特异结合，决定了PCR的特异性；引物能否被DNA聚合酶有效延伸，决定了PCR的灵敏性。

2、引物设计原则

长度：15-30nt，longPCR或某些特殊的PCR需使用较长的引物。 碱基分布：随机分布，同一碱基不应连续出现超过4次。 GC含量：一般40-60%。太低会导致引物Tm值较低，不利于PCR的特异性；太高则不利于引物结合，亦能引发非特异扩增。→Tm值(55℃-65℃)过低，PCR特异性低；过高，PCR效率低，

课后测试

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测试成绩：73.33分。 恭喜您顺利通过考试！

单选题

1. 下列选项中，应该纳入绩效考评范畴的是： √

A 工作态度

B 工作能力

C 员工的创新建议

D 工作完成情况

正确答案： D

2. 对建议、培训等此类项目内容，需要体现的价值指导原则是： √

A 规范的价值

B 员工的价值

C 企业的价值

D 社会价值

正确答案： C

3. 下列关于绩效考评的要点，说法错误的是： ×

A 主要考评员工的工作能力

B 绩效考评应只考评工作任务

C 岗位干什么，就考评什么

D 部门重视什么，就考评什么

正确答案： A

4. 下列关于绩效考评与能力考评的区别，说法错误的是： √

A 能力考评基于任职能力的素质模型，绩效考评基于绩效考评指标

B 能力考评的用途很广泛，绩效考评一般用于晋升、调岗、调职等

C 能力考评为多方位考评，绩效考评由考评者直接考评

D 能力考评通常为一年一次，绩效考评为一月一次

正确答案： B

5. 考评标准的制定，需要（ ）合作完成。 ×

领导、企业、个人B 领导、个人、专业人员

C 企业、个人、专业人员

D 企业、领导、专业人员

正确答案： B

6. 下列关于考评标准制定的