wb实验视频

WB 实验步骤

1. 蛋白提取，吸出培养基，用适量DPBS清洗，吸出DPBS，尽量吸干净，加入适量细胞裂解液，冰上裂解15-30min

2. 用细胞刮刀刮取皿或瓶底部的细胞，收集至1.5ml的离心管中，12000rpm离心，4度，15-30min将上清转移到新的离心管中 3. 检测蛋白浓度，定量（20-40ug），用水和蛋白上样缓冲液配成30ul以内的体积，100度变性10min，冷却后离心，上样

4. 将胶装在电泳槽内，加入1x电泳缓冲液到指定刻度，拔出梳子用注射器清洗胶孔，上样 5. 60V电压压缩蛋白至同一位置（分离胶与浓缩胶交界处），130V分离蛋白。配置转膜缓冲液，并将膜浸泡其中，4度预冷

6. 待蓝色的缓冲液条带到达距离胶底面0.5cm处即可开始转膜，按照从负极到正极海绵，滤纸，胶，膜，滤纸，海绵的顺序组装，避免产生气泡，对应正负极放入转膜槽

7. 低温转膜90min，丽春红染色，初步判定WB效果，并在对应位置将目的条带剪下来 8. 用5%的脱脂牛奶封闭，室温1小时以上，用特定的一抗4度过夜 9. 清洗一抗，用适量的TBST，室温3次，每次10min

10. 加入对应的二抗，室温孵育1小时以上，并清洗3次，同9 11. 按1:1的

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳和Western印迹技术

SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳技术首先在1967年由Shapiro等建立，主要用于测定蛋白质亚基分子量。Western 印迹是在SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳基础上，将电泳分离的蛋白组分从凝胶转移至一种固相支持物上，应用抗体可与附着于固相支持物上的靶蛋白发生特异性反应的特点，针对特定蛋白进行鉴别和定量。 原理

1． SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳

SDS是一种阴离子去污剂，作为变性剂和助溶剂，它能断裂分子内和分子间的氢键，使分子去折叠，破坏蛋白质分子的二级和三级结构。强还原剂，例如巯基乙醇和二硫苏糖醇则能使半胱氨酸残基之间的二硫键断裂。在样品和凝胶中加入SDS和还原剂后，蛋白质分子被解聚，使其氨基酸侧链与SDS充分结合形成带负电荷的蛋白质-SDS胶束，所带的负电荷大大超过了蛋白质分子原有的电荷量，这就消除了不同分子之间原有的电荷差异。在水溶液中蛋白质-SDS胶束的长度与亚基分子量的大小成正比。因此这种胶束在SDS聚丙烯酰胺凝胶系统中的电泳迁移率不再受蛋白质原有电荷的影响，而主要取决于蛋白质或亚基分子量的大小。当蛋白质的分子量在15KD～200KD之间时，电泳迁移率与分子量的对数呈线性关系。由此可见，SDS聚丙烯

实验基本步骤

提取细胞蛋白

↓ BCA定量

↓

制备蛋白胶（SDS-PAGE胶）

↓

蛋白样品变性

↓ 电泳 ↓ 转膜 ↓ 封闭 ↓ 一抗 ↓ TBST洗涤

↓ 二抗 ↓ TBST洗涤

↓ 显影 ↓ 结果分析

试剂配制

1.PBS磷酸盐缓冲溶液1L

磷酸二氢钾 0.24g 磷酸氢二钠 1.44g 氯化钠 8g 氯化钾 0.2g

加入500ml纯水，调PH=7.2 定容至1L,高压蒸汽灭菌

2.PBST（PBS+0.05%吐温-20）

500mlPBS+0.25ml吐温-20

3.电转液500ml

Tris 1.5g 甘氨酸 7.2g 400ml水溶解

加入100ml甲醇，置于4℃冰箱预冷

4.电泳液（1X）

10x稀释，50ml10x电泳液+450ml纯水

5.TBS

6.TBST（TBS+0.05%吐温-20）

50mlTBS+450ml纯水+0.25ml吐温-20

7.封闭液

TBST1X+5%奶粉

40ml封闭液=40mlTBST+2g奶粉，40℃预热

WB实验

一、蛋白样品制备

准备:一管细胞，PBS（4℃预冷），PMSF（100mM），移液枪（

实验基本步骤

提取细胞蛋白

↓ BCA定量

↓

制备蛋白胶（SDS-PAGE胶）

↓

蛋白样品变性

↓ 电泳 ↓ 转膜 ↓ 封闭 ↓ 一抗 ↓ TBST洗涤

↓ 二抗 ↓ TBST洗涤

↓ 显影 ↓ 结果分析

试剂配制

1.PBS磷酸盐缓冲溶液1L

磷酸二氢钾 0.24g 磷酸氢二钠 1.44g 氯化钠 8g 氯化钾 0.2g

加入500ml纯水，调PH=7.2 定容至1L,高压蒸汽灭菌

2.PBST（PBS+0.05%吐温-20）

500mlPBS+0.25ml吐温-20

3.电转液500ml

Tris 1.5g 甘氨酸 7.2g 400ml水溶解

加入100ml甲醇，置于4℃冰箱预冷

4.电泳液（1X）

10x稀释，50ml10x电泳液+450ml纯水

5.TBS

6.TBST（TBS+0.05%吐温-20）

50mlTBS+450ml纯水+0.25ml吐温-20

7.封闭液

TBST1X+5%奶粉

40ml封闭液=40mlTBST+2g奶粉，40℃预热

WB实验

一、蛋白样品制备

准备:一管细胞，PBS（4℃预冷），PMSF（100mM），移液枪（

实验基本步骤

提取细胞蛋白

↓ BCA定量

↓

制备蛋白胶（SDS-PAGE胶）

↓

蛋白样品变性

↓ 电泳 ↓ 转膜 ↓ 封闭 ↓ 一抗 ↓ TBST洗涤

↓ 二抗 ↓ TBST洗涤

↓ 显影 ↓ 结果分析

试剂配制

1.PBS磷酸盐缓冲溶液1L

磷酸二氢钾 0.24g 磷酸氢二钠 1.44g 氯化钠 8g 氯化钾 0.2g

加入500ml纯水，调PH=7.2 定容至1L,高压蒸汽灭菌

2.PBST（PBS+0.05%吐温-20）

500mlPBS+0.25ml吐温-20

3.电转液500ml

Tris 1.5g 甘氨酸 7.2g 400ml水溶解

加入100ml甲醇，置于4℃冰箱预冷

4.电泳液（1X）

10x稀释，50ml10x电泳液+450ml纯水

5.TBS

6.TBST（TBS+0.05%吐温-20）

50mlTBS+450ml纯水+0.25ml吐温-20

7.封闭液

TBST1X+5%奶粉

40ml封闭液=40mlTBST+2g奶粉，40℃预热

WB实验

一、蛋白样品制备

准备:一管细胞，PBS（4℃预冷），PMSF（100mM），移液枪（

实验基本步骤

提取细胞蛋白

↓ BCA定量

↓

制备蛋白胶（SDS-PAGE胶）

↓

蛋白样品变性

↓ 电泳 ↓ 转膜 ↓ 封闭 ↓ 一抗 ↓ TBST洗涤

↓ 二抗 ↓ TBST洗涤

↓ 显影 ↓ 结果分析

试剂配制

1.PBS磷酸盐缓冲溶液1L

磷酸二氢钾 0.24g 磷酸氢二钠 1.44g 氯化钠 8g 氯化钾 0.2g

加入500ml纯水，调PH=7.2 定容至1L,高压蒸汽灭菌

2.PBST（PBS+0.05%吐温-20）

500mlPBS+0.25ml吐温-20

3.电转液500ml

Tris 1.5g 甘氨酸 7.2g 400ml水溶解

加入100ml甲醇，置于4℃冰箱预冷

4.电泳液（1X）

10x稀释，50ml10x电泳液+450ml纯水

5.TBS

6.TBST（TBS+0.05%吐温-20）

50mlTBS+450ml纯水+0.25ml吐温-20

7.封闭液

TBST1X+5%奶粉

40ml封闭液=40mlTBST+2g奶粉，40℃预热

WB实验

一、蛋白样品制备

准备:一管细胞，PBS（4℃预冷），PMSF（100mM），移液枪（

蛋白提取（所有操作在冰上进行）

1.裂解

1)配裂解液：PMSF=100：1，（裂解液和PMSF在-20℃保存，提

前一天4℃解冻）

取2ml裂解液，加20μl PMSF混匀

2)称取30mg组织，切碎放入标记好的AP管中，加入600μl上

述1中液体（加入液体与组织比例为20：1），冰上静置10min 2.匀浆

先用超纯水润洗一下匀浆机的钢头，（同时进行几组匀浆时，组间也要润洗钢头）

在匀浆机（在生化室）上每次匀浆10s，两次（间隔5s），冰上静置30min

3.离心（在基础4楼416室）

1)自带1ml枪以及蓝枪头和黄枪头，三个1.5的离心管（①，②

两个标记，③加少量超纯水，③号是为了离心平衡，对称放置）

2)将离心机预冷至4℃为止，以1200×10r/min离心15min

3)用移液枪将上层清液取出放入①②号管中

4.变性（上样缓冲液：样品=4：1）

将样品转移至2~3个0.5mlAP管中

加上样缓冲液，100℃变性10min

仪器屏幕：

5.保存

变性结束后，打开AP管盖放一下气，然后4℃保存，点样是取出即可用

WB实验步骤

1.清洗玻璃板：清洗玻璃板后风干，将玻璃板对齐后放入夹中卡紧，

操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。

2.配制分离胶

1)准备：1ml枪（蓝色枪头），200μl

蛋白提取（所有操作在冰上进行）

1.裂解

1)配裂解液：PMSF=100：1，（裂解液和PMSF在-20℃保存，提

前一天4℃解冻）

取2ml裂解液，加20μl PMSF混匀

2)称取30mg组织，切碎放入标记好的AP管中，加入600μl上

述1中液体（加入液体与组织比例为20：1），冰上静置10min 2.匀浆

先用超纯水润洗一下匀浆机的钢头，（同时进行几组匀浆时，组间也要润洗钢头）

在匀浆机（在生化室）上每次匀浆10s，两次（间隔5s），冰上静置30min

3.离心（在基础4楼416室）

1)自带1ml枪以及蓝枪头和黄枪头，三个1.5的离心管（①，②

两个标记，③加少量超纯水，③号是为了离心平衡，对称放置）

2)将离心机预冷至4℃为止，以1200×10r/min离心15min

3)用移液枪将上层清液取出放入①②号管中

4.变性（上样缓冲液：样品=4：1）

将样品转移至2~3个0.5mlAP管中

加上样缓冲液，100℃变性10min

仪器屏幕：

5.保存

变性结束后，打开AP管盖放一下气，然后4℃保存，点样是取出即可用

WB实验步骤

1.清洗玻璃板：清洗玻璃板后风干，将玻璃板对齐后放入夹中卡紧，

操作时要使两玻璃对齐，以免漏胶。

2.配制分离胶

1)准备：1ml枪（蓝色枪头），200μl

蛋白提取（所有操作在冰上进行）

1. 裂解

1) 配裂解液：PMSF=100：1，（裂解液和PMSF在-20℃保存，提前一天4℃解冻）

取2ml裂解液，加20μl PMSF混匀

2) 称取30mg组织，切碎放入标记好的AP管中，加入600μl上述1中液体（加入液

体与组织比例为20：1），冰上静置10min

2. 匀浆

先用超纯水润洗一下匀浆机的钢头，（同时进行几组匀浆时，组间也要润洗钢头） 在匀浆机（在生化室）上每次匀浆10s，两次（间隔5s），冰上静置30min 3. 离心（在基础4楼416室）

1) 自带1ml枪以及蓝枪头和黄枪头，三个1.5的离心管（①，②两个标记，③加少量

超纯水，③号是为了离心平衡，对称放置）

2) 将离心机预冷至4℃为止，以1200×10r/min离心15min 3) 用移液枪将上层清液取出放入①②号管中 4. 变性（上样缓冲液：样品=4：1）

将样品转移至2~3个0.5mlAP管中 加上样缓冲液，100℃变性10min 仪器屏幕：

5. 保存

变性结束后，打开AP管盖放一下气，然后4℃保存，点样是取出即可用

S5 S5 100．0 00：10 00：10 温度（℃） 时间（时：分钟） WB实验步骤

Western blot 步骤： 配胶 制胶 跑胶

转移胶（转膜）

封闭和孵抗体 扫膜

一.配胶

这些小孔的孔径随 “双丙烯酰胺～丙烯酰胺” 比率的增加而变小，比率接近 1：20 时孔径达到最小值。SDS聚丙烯酰胺凝胶大多按“双丙烯酰胺～丙烯酰胺”为1：29 配制，试验表明它能分离大小相差只有3% 的蛋白质。

1.分离胶（按照自己目的蛋白的大小说明选择合适的浓度） 2.浓缩胶

均可事先配好（除AP及TEMED外），过滤后作为储存液避光存放于4℃，可至少存放1个月，临用前取出室温平衡（否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡，有条件者可真空抽吸3分钟），加入10%AP（0.7~0.8:100, 分离胶浓度越高AP浓度越低，15%的分离胶可用到0.5:100）及TEMED（分离胶用0.4:1000, 15%的可用到0.3:1000，浓缩胶用0.8：1000）

PAGE配胶的试剂和配方比例对电泳结果的质量当然有决定性的影响，这个配胶的比例，在《分子克隆》上有详细的论述，相信大家都不难查到。容易忽视的问题主要在于过硫酸铵（AP）一定要新鲜——最好用小指管配AP（写日期）保存