免疫组化分析

CD56+,NSE+SYN局灶+,S-100 CGA-,都是神经分泌组织的特异性标记物。

CD34-常用于标记血管内皮细胞，血管源性肿瘤

CD20-,CD3-,CD31-淋巴瘤标记，

CK是上皮组织标记。临床做CK,这里是指广谱的CK，是判断肿瘤是不是上皮来源的。CK19是CK的一个亚型，也有它自己的意义，一般在恶性程度越低的肿瘤中，表达越高，这和广潽的CK的意义有点相反

KI-67 细胞增殖标志，阳性率越高，肿瘤增殖越快，恶性程度越高。

CK局灶+,

CD56+我查过一些有关于CD56(NCAM)的文章,在多种肿瘤组织的表面可以检测到CD56的表达,然而未见到其表达于喉癌组织.

,NSE+,溶血后NSE可以升高，如果查肺部没问题，建议不妨在复查看看值高不高。

正常值 正常人血清NSE水平＜12.5 U／mL目前，NSE已作为小细胞肺癌重要标志物之一。 意义 1．小细胞肺癌患者NSE水平明显高于肺腺癌、、肺鳞癌、大细胞肺癌等非小细胞肺癌（NSCLC），可用于鉴别诊断，监测小细胞肺癌放疗，化疗后的治疗效果，治疗有效时NSE浓度逐渐降低至正常水平，复发时血清NSE升高。用神经元特异性烯醇化酶监测小细胞肺癌的复发，比临床确定复发要早4～

免疫组织化学 第一节 概 述

1、概念：免疫组织化学(IHC)又称免疫细胞化学。它是组织化学的分支，是应用免疫学及组织化学的原理，对组织切片中的某些化学成分进行原位显示的技术。

采用标记的特异性抗体（或抗原）对组织内抗原（或抗体）的分布进行组织和细胞原位检测，检测相应的目的抗原（或抗体）,并进行定位、定性和定量分析。

实际上该法是以免疫学方法取代化学方法的一种特殊的组织化学染色技术。 免疫组织化学技术的出现和发展给传统病理学带来了一场革命，使纯形态的病理学发展成为了形态与免疫信号相结合的现代病理学。其技术应用20多年来对临床病理诊断产生了深刻的影响，目前已成为了病理诊断中不可缺少的、最重要的辅助手段。 2、发展史

3、免疫组织化学的临床应用

适用于蛋白水平上组织的抗原或抗体检测。凡是组织细胞内具有抗原性的物质，如肽类、激素、神经递质、细胞因子、受体、表面抗原等均可用免疫组织化学方法显示，因而目前在基础与临床科研中被广泛应用。 主要用于常规石蜡切片难以完成的疑难肿瘤的诊断

（1）对肿瘤的组织起源进行鉴别诊断，确定转移性恶性肿瘤的原发部位 （2）对肿瘤的良恶性进行综合判断

（3）对肿瘤进行进一步的病理分

免疫组化步骤

1、 烤片：放于60℃烘箱内，20-25min； 2、 脱蜡：二甲苯I、II、III，3次，5min/次；

注：从烘箱中拿出迅速放入二甲苯中，防止蜡凝；

3、 复水：100%酒精---100%酒精---95%酒精---90%酒精---80%酒精

---70%酒精---50%酒精，5min/次； 4、 ddH2O洗2次，5min/次；

5、 抗原修复：柠檬酸盐抗原修复液1x（迈新MVS-0100），125℃，

5min；

注：1x修复液：198ml ddH2O + 2ml抗原修复液100x,混匀；

抗原修复高压锅的使用：确定垫圈和导热片的放入，加入700ml ddH2O，放入铁架固定切片盒，注意不要压到导热片，盖上锅盖检查排气嘴是否可以自由旋转，锅盖上的“close”对准白点，“open”所指处与边缘无缝隙，设置程序，开始；结束后等到排气口的红色指示消失即可打开锅盖；

6、 修复结束后冷却至室温（30min），1xPBS洗2次，5min/次； 7、 去除 H202酶：3%H202，15min；注意遮光；

注：用1xPBS稀释30% H202至3% H20（如5ml 30% H202+45ml 2PBS 50ml 3%H202）

免疫细胞化学常用试剂介绍 佚名

一、固定剂

大多数神经激素、肽类物质为水溶性，在用于免疫细胞化学研究之前，常需固定。但肽类和蛋白质的物理、化学性质不同，因而对不同的固定方法或固定剂的反应也不尽相同。某些固定剂甚至可同时破坏和/或保护同一抗原的不同抗原决定簇。因此，在进行免疫细胞化学研究之前，很有必要了解所要研究的物质（蛋白质或肽类）的化学性质，并根据需要来选择适宜的固定剂（或固定方法）以及改进固定条件。

目前，免疫细胞化学研究中常用的固定剂仍为醛类固定剂，其中以甲醛类和戊二醛最为常用。在此，简要介绍几种目前较为常用和推荐的固定剂，以供读者选用。

1.4%多聚甲醛-0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.3）

试剂：多聚甲醛 40g

0.1mol/L磷酸缓冲液 至1000ml

配制方法：称取40g多聚甲醛，置于三角烧瓶中，加入500～800ml 0.1mol/L磷酸缓冲液（Phosphate Buffer以下简称PB），加热至60℃左右，持续搅拌（或磁力搅拌）使粉末完全溶解，通常需滴加少许1n NaOH才能使溶液清亮，最后补足0.1mol/L的PB于1000ml，充分混匀。

免疫组化操作流程

试剂准备

1. PBS缓冲液（pH7.2～7.4）： NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L，KH2PO4 1.4mmol/L。

2. 0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000ml）：柠檬酸三钠 3g，柠檬酸 0.4g。即抗原修复液

3.PBST: PBS+吐温-20（1000:1）洗液可全部运用PBST

4. 3% 甲醇-H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制。

5. 封片剂：中性树脂+二甲苯。

操作流程

免疫组织化学染色

SP法：

1. 脱蜡、水化：

脱蜡前，应将切片在60℃恒温箱中烘烤60~120分钟，观察石蜡应溶解。

从烤箱拿出切片后尽快置于二甲苯中浸泡30分钟，更换二甲苯后再浸泡30分钟；

无水乙醇中浸泡3分钟；

95%乙醇中浸泡3分钟；

70%乙醇中浸泡3分钟（我用80%）；

50%乙醇中浸泡3分钟；

自来水中浸泡3分钟；

梯度脱蜡

2. 抗原修复：（用于福尔马林固定的石蜡包埋组织切片）

高压热修复 高压锅里放少许水，用一量杯或容器（大小能容纳玻片架为宜）装抗原修复液放入高压锅里一起煮沸，再放入玻片架，盖上不锈钢高压锅的盖子，将排气阀门套上，待听到阀门冒气时，即可倒计

石蜡切片免疫组化实验步骤

石蜡切片步骤按照晓峰整理的步骤进行（From 徐晓峰、朱老师的“石蜡切片”方案）： 1）材料的准备

在本实验室条件下推荐使用FAA（50% ethanol, 5% acetic acid, 3.7% 甲醛）固定材料。

FAA固定液（100ml），室温保存 ：

无水乙醇 50ml 冰醋酸 5ml 37%甲醛 10ml 水 35ml

第一天：组织固定

用FAA固定，详见“石蜡切片”protocol。 第二天：脱水

Solution 50% ethanol 60% ethanol *70% ethanol time 60 minutes 60 minutes 60 minutes number of changes one one one 以上所有步骤中每换好一步乙醇均置于4℃冰箱等待，并不时轻摇。 * 组织可在70% ethanol 4℃可存放几个月

第三天：进一步脱水和浸蜡

1

以下所有步骤在4℃进行并不时轻摇

Solution time number of changes 85% eth

临床病理工作中，我们常用到“肿瘤细胞免疫组化耐药预后标记”，但是许多单位只写阳性结果，不写临床意义，其结果对临床帮助不大，因为许多医生不懂得这些结果的意义，因此建议大家在出此类报告时，把“肿瘤细胞免疫组化耐药预后标记”的意义打印在报告中，以增加病理报告的使用价值。

1、恶性肿瘤免疫组化耐药预后标记，全套4项：P-gP，GSTπ，TOPOⅡ，Ki-67。

2、乳癌免疫组化耐药预后标记，全套7项：P-gp，GSTπ，TOPOⅡ，Ki-67，ER，PR，C-erbB-2。

3、意义：标记物--作用--阳性部位--临床意义

多药耐药基因蛋白（P-Gp）--药泵作用--胞膜/胞浆--阳性率越高，对下列药物耐药性越强：阿霉素、柔红霉素、表阿霉素、米托蒽醌、长春花碱、长春新碱、紫彬醇、泰素帝。

谷光甘肽S转移酶（GST π）--解毒作用--胞浆--阳性率越高，对下列药物耐药性越强：阿霉素、顺铂、氮芥、环磷酰胺、瘤可宁。

拓扑异构酶Ⅱ（TOPOⅡ）--靶点作用--胞核--阳性率越高，对下列药物越有效：蒽环类抗生素和鬼臼毒素类，如VP16、替尼泊苷、玫瑰树碱、新霉素、柔红霉素、表阿霉素、阿霉素、VM26。阳性率高者对VP16尤其有效。

雌激素受体（ER）--性激素作用--胞

常用免疫组化指标的意义

Ki-67为细胞增殖的一种标记，在细胞周期G1、S、G2、M期均有表达，G0期缺如，其和许多肿瘤分化程度、浸润、转移、预后密切相关。PCNA(增殖细胞核抗原)。多数腺癌表达CEA

Rb (retinoblastoma视网膜母细胞瘤) 基因是肿瘤抑制基因，调节细胞周期。 P53在免疫组化中均为突变型，阳性率越高，预后约差。野生型半衰期很短 Nm23是转移抑制基因，其阳性表达和肿瘤转移呈负相关。

E-Ca E钙粘附蛋白，介导细胞间粘连作用的跨膜糖蛋白，其功能丧失引起细胞之间连接的破坏，主要用于肿瘤侵袭和转移方面的研究。 PS2 （雌激素调节蛋白），其表达和ER表达有关，可作为内分泌治疗和预后判断的指标之一。

CK18 低分子量角蛋白，主要标记各种单层上皮包括腺上皮，而复层鳞状上皮常阴性，主要用于腺癌诊断。

CK19 分布于单层上皮和间皮，常用于腺癌诊断，肝细胞不表达，而胆管为阳性反应

Hep par 肝细胞抗原，正常肝细胞和高分化肝细胞癌阳性，低分化肝细胞癌多弱阳性或阴性。

CK20 用于胃肠道腺癌、卵巢黏液性肿瘤、皮肤Merkel细胞癌诊断。鳞癌、乳腺癌、肺癌、子宫内膜和卵巢非黏液性肿瘤常阴性。

CK7 卵巢、肺和

冰冻切片免疫组化步骤

1. 需要准备的材料

APES包被的载玻片 PBS（pH7.4） 4%多聚甲醛

PBST（含Tween-20）

PBST-G（含0.3mol/L甘氨酸）

2. 冰冻切片

取出组织块放于软塑料盖或特制的小盒内，之后将其缓慢平放于盛有液氮的小杯内，让盒底部接触液氮（小盒及组织块切勿浸入液氮内），大约10-20秒组织即迅速冰冻成块。取出组织冰块立即置于-80℃冰箱储存备用，或置于恒温切片机冰冻切片。

切片厚度4-8 um (5 um)，对于免疫组化的需要用APES包被的载玻片，以增加组织片的粘附性。

切片后如不立即染色，必须吹干，储存于低温冰箱内保存。

3. 免疫组化染色步骤

固定：取出切片，室温放置5mins。用4%的多聚甲醛PBS溶液室温固定15mins，PBS冲洗三次（冲洗可以采用侧斜淋洗，也可至于平皿中摇晃）。

打孔：如果是需要染细胞内的蛋白，用曲拉通（TritonX-100）打孔：组织样品浸于含0.25% TritonX-100的PBS中10mins，之后用PBS洗3次，每次5mins。如果是染膜蛋白的，不需要曲拉通打孔。

封闭：将组织置于含1%BSA的PBST溶液中30mins，封闭非特异性粘合的抗体。对于多聚

非标记抗体酶法

由于酶标抗体存在一些缺点，例如①酶与抗体间的共价连结可损害部分抗体和酶的活性；②抗血清中的非特异性抗体被酶标记后，与组织成分结合，可致背景染色等。为此Sternberger等在酶标法的基础上，发展了非标记抗体酶法。包括酶桥法（Enzyme Bridge Method）和过氧化物酶抗过氧化物酶法（Peroxidase Antiperoxidase Method, PAP法）。现分述如下。 （一）酶桥法

1．基本原理 首先用酶免疫动物，制备效价高、特异性强的抗酶抗体，然后使用第二抗体作桥，将抗酶抗体连结在与组织抗原结合的第一抗体上，再将酶结合在抗酶抗体，经呈色显示抗原的分布。在此过程中，任何抗体均未被酶标记，酶是通过免疫学原理与抗酶抗体结合，避免了共价连结对抗体和酶活性的损害，提高方法的敏感性，且能节 省第一抗体的用量。

2．染色步骤 主要程序如图4-4

图4-4 酶桥法主要染色步骤

（1）切片准备及第一抗体孵育前处理同间接法，第一抗体（假设来自种属A）孵育24h（4℃）。第一抗体的稀释度可高些，使抗体的两个Fab段均与组织抗原结合，较牢固，漂洗时不易丢失。

（2）切片与第二抗体（也称桥抗体，抗种属a I