药敏纸片的制备及药敏试验方法

药敏纸片的制备及药敏试验方法抗菌药物对预防或治疗动物疾病发挥了巨大的作用，但随着抗菌药物在兽医临床的广泛使用，尤其为了防治疾病，常常以亚剂量水平的药物添加于饲料中，以致长期使用后病原微生物产生了耐药性，使本来对治疗病原微生物感染有效的抗菌药物失去作用，给兽医临床上有效地预防和治疗疾病的发生带来一定的困难。通过制作自家药敏纸片进行试验,可快速进行药物的筛选,获得对病原微生物敏感的药物, 对指导临床合理用药，提高治疗效果，节约养殖过程的用药费用，有着重要的意义。

一. 药敏纸片的制备

1.材料

抗菌药物、磷酸二氢钠、磷酸氢二钠、冰醋酸、新华1号定性滤纸、50mL容量瓶、无菌过滤器或一次性过滤器等

2．方法

PBS的配制

A.制备L储备液

LNa2HPO4 ： +1000 mL蒸馏水

或 +1000 mL蒸馏水

L NaH2PO4 : +1000 mL蒸馏水

或 +1000 mL蒸馏水

B.将两种储备液按下表比例，配制成不同pH值的PBS,室温保存备用

L磷酸缓冲液的配制

抗菌药物原液的配制和保存期限

抗菌药物配制溶剂和保存期限

抗菌药物溶剂浓度（ g/mL）－20℃4℃

青霉素 PBS 1280 3个月1周

半合成青霉素类 PBS 1280 3个月1周

头孢菌素类 PBS 1280

摘要:药敏试验能够快速的确定病原菌以及药物敏感结果，加强耐药监测，减少用药的盲目性，合理使用抗生素有效控制感染，避免耐药菌的产生，提升治愈率。临床微生物实验室应选择先进、方便的方法进行常规的抗菌药物敏感实验。

关键词:临床,常用,细菌,药敏,试验,方法，药敏,试验,能够,快速

药敏试验能够快速的确定病原菌以及药物敏感结果，加强耐药监测，减少用药的盲目性，合理使用抗生素有效控制感染，避免耐药菌的产生，提升治愈率。临床微生物实验室应选择先进、方便的方法进行常规的抗菌药物敏感实验。

一、国内常用常用的四种方法:

第一种纸片扩散法

原理:将含有定量抗菌药物的纸片贴在已接种测试菌的琼脂平板上，在纸片周围抑菌浓度范围内测定菌的生长被抑制，从而形成无菌生长K的透明圈即抑菌圈。其大小反映测试菌对测定药物的敏感性，并与该药对测试菌的最低抑菌浓度呈负相关。

优点:药敏试验具有重复性好、操作简便、试验成本相对较低、结果直观、容易判读、便于基层开展等。

缺点:其虽是一一种传统、经典的药敏试验方法，但随着全自动微生物分析仪的推广和应用，K-B 纸片扩散法出现药敏试验假耐药、受人为因素影响较大、试验耗时长的缺点也渐渐体现出来，同时快速性、准确性方面存在不足[1]。

应用:应用于兼性厌氧

细菌分离培养方法及操作步骤

无菌取血液或脏器、淋巴结划线接种于鲜血琼脂平板或血清琼脂平面培养基、普通肉汤培养基，37℃恒温培养24 h，观察其生长特性。目前细菌分离培养的常用方法有平板划线分离法、加热分离法和实验动物分离法。

平板划线接种法

这是目前临床上最常用的分离接种方法。它可以从被检病料中通过划线可使细菌分离、分散生长而形成单个菌落（有利于从含有多种细菌的标本中分离出目的菌），以便挑选可疑菌落作纯培养加以鉴定。具体操作：

1、右手持接种环，在酒精灯上火焰灭菌；

图1 病料采集 图2 接种环灭菌

2、待接种环冷却后，挑取被检料少许，左手持琼脂平板，以食

指为支点，用拇指和无名指将平皿揭开一空隙。大约20℃时，迅速地将接种环轻轻地涂布在培养基的边缘。

3、在涂布处来回移动作曲线形划线接种。（注意：划线时，以腕力使接种环在琼脂平板表面划动，尽量不要划破培养基，划的线条要密，但不能重复旧线，以免培养物形成菌苔。）

图3 平板划线接种法

4、划线完毕，合上平皿盖，将琼脂平板倒置，放入37℃温箱内培养18－24小时。

注意：分离培养用的平板培养基应表面干燥，可于临用前置37℃孵育箱内30分钟，这样表面即干

大肠杆菌的分离以及药敏试验（悠然）

摘 要：山东某集团送检的疑似大肠杆菌病的病死鸡的心、肝、脾，进行病原菌的分离、鉴定和药敏试验。结果显示引起该鸡场鸡只发病的病原为大肠杆菌，对阿米卡星、新霉素敏感，对头孢和新霉素的复方制剂中度敏感，几乎对可克林霉素不敏感。表明该鸡场出现了耐药的致病性大肠杆菌，在以后的肉鸡生产中应慎用抗生素，在使用药物治疗大肠杆菌病时，应根据药敏试验结果，选择敏感药物，且应注意交替用药，按疗程投药。 关键词：大肠杆菌；分离鉴定；致病性；药敏试验

大肠杆菌病是由大肠杆菌某些血清型菌株引起的一类疾病的总称。各个品种和日龄的鸡均可发病，但肉仔鸡最易感。随着养禽业的迅速发展与高度集约化饲养，鸡大肠杆菌病已成为鸡群重要的疾病之一。为了控制鸡大肠杆菌在鸡群中的传播，我们对送检的疑似大肠杆菌病例进行病原的分离鉴定，并对分离菌的培养特性、致病力及抗菌药物的敏感性进行了研究，为有效防制鸡大肠杆菌病提供了依据。 1 材料与方法 1.1 病料来源

2006年11月山东省某集团养殖场场送检的疑似大肠杆菌病的病料若干，已死亡鸡只死亡时间不超过24 h。 1.2 细菌分离培养

无菌采集病、死鸡的肝脏、心血等组织，接种在普通琼脂平板及普通肉汤，37℃培

从山东某繁育猪场送检的疑似病例中分离到4株革兰氏阴性细小杆菌,通过培养特性试验和生化试验初步诊断为副猪嗜血杆菌,根据副猪嗜血杆菌16SrRNA序列设计引物,进行PCR鉴定,结果表明4株分离菌株为副猪嗜血杆菌。对4株分离菌株进行小白鼠毒力试验和药敏试验,结果表明,4株分离菌能致死小白鼠,对头孢他啶、头孢噻呋、氧氟沙星、多西环素、环丙沙星敏感,对土霉素、链霉素、林可

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山东畜牧兽医

2O年第 2卷 O8 9

副猪嗜血杆菌的分离鉴定和药敏试验研究宋风香①②闰振贵①姜世金 (山东农业大学动物科技学院泰安① 2 11②德州市畜牧局 ) 70 8 摘要从山东某繁育猪场送检的疑似病例中分离到 4株革兰氏阴性细小杆菌，通过培养特性试验和生化试验初步诊断为副猪嗜血杆菌，根据副猪嗜血杆菌 1SrNA序列设计引物，进行 P R鉴定，结果 6 R C表明 4株分离菌株为副猪嗜血杆菌。对 4株分离菌株进行小白鼠毒力试验和药敏试验，结果表明，4株分离菌能致死小白鼠，对头孢他啶、头孢噻呋、氧氟沙星、多西环素、环丙沙星敏感，对土霉素、链霉素、林可霉素抵抗。 关键词副猪嗜血杆菌分离鉴定药敏试验 中图分类号：￥ 5 .8 882文献

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我院小儿血液细菌培养及药敏分析

作者：王美烨

来源：《中国实用医药》2015年第01期

【摘要】 目的 了解本院小儿血液细菌培养的分布和生长状况以及对药物敏感的分析情况。方法 对本院血培养检出菌株进行定性分析。对阳性菌株进行鉴别检验和体外药物敏感试验。结果 小儿血液细菌培养的阳性率为37.17%。分离菌株中， G+菌占54.7%， 其中表皮葡萄球菌占43.8%， 位于第一位。易产生耐药的微球菌和肠球菌分别占17.3%、4.1%， 分别居于第三、五位。结论 小儿血液感染病原菌种类多， 耐药性差异大， 耐药率高。 【关键词】 血液细菌；耐药性；药敏分析

败血症是严重威胁少年儿童健康的三大疾病之一， 平均死亡率为28%～37%， 尤其是耐药菌株种类和数量的增加， 使得感染患儿的有效治疗变得十分困难[1， 2]。败血症的临床表现没有特异性， 目前临床上仍以血液培养阳性为诊断标准[3， 4]。为了解败血病小儿血病原菌培养分布和对抗生素的耐药情况， 文章对本院426例血液培养阳性患儿的病原菌分布及药敏情况进行研究， 以便在临床上选择最佳的治疗方案。

微量肉汤稀释法药敏检测

以下实验方法主要适用于需氧菌及部分兼性厌氧菌（以大肠杆菌为例），微需养菌和厌氧菌的培养条件亟待摸索。本实验方法，虽然操作较为繁琐，但是能够确切的得到细菌临床分离株对某种抗菌药物的MIC值，以此作为临床用药指导的部分依据。 菌悬液的制备：

① 菌液培养：取待测菌保存液10μL加入1mLMH肉汤（可根据实际需要做调整），置37℃温箱过夜静止培养12小时左右；

② OD600值测定：利用紫外分光光度仪测定OD值，MH肉汤调整菌液浓度使其OD600值落在0.08-0.1之间，此时菌液浓度约10cfu/mL（大约需将培养菌液稀释7-10倍左右）； ③ 上样菌液稀释：将待测菌液在步骤②所得稀释倍数的基础上再稀释1000倍，此时菌液浓度约10cfu/mL（即7000-10,000倍），此时的菌液即为上样菌悬液； 注意：测定OD值所需菌液应在超净台中无菌取样，剩余菌液还需实验。 抗菌药物的制备：

抗生素母液配制：参照NCCLS标准上抗菌药物相应的R（抗药）值制备待测抗菌药物（母液浓度要远远大于R值，至少160倍），分装于无菌小管置-20℃备用（附件一.常用抗生素溶液的配制）。

5

8

注意：无菌操作，抗菌药物的稀释液均需灭菌，溶解后

第二章 试验方法及原理

2.1实验过程

原材料 冷轧变形 线切割 表面处理 热处理 电解抛光 做标记 EBSD 10%变形 EBSD 退火处理 EBSD

2.2 样品制备

2.2.1实验材料

本工作的材料是纯度为99%以上呈紫红色光泽的金属铜块,外径尺寸为30毫米的正方

形。

2.2.2样品的变形方式 2.2.2.1 轧制（大变形）

原样品采用双辊轧机（外型如下图）轧制变形到厚度为4毫米的薄铜片，大变形约为86.7%

2.2.2.2 线切割

把轧制好的薄铜片在电火花线切割机上通过编程后自动切制成外径尺寸为4×4×11毫米的小样品。

1.缠丝，调整行程 2.装夹试样（注意角度）3.编程：绘图—直线—俩点直线—起点（0，0）—（x,y）—存盘—轨迹（0，0）—退出—Yes Yes—模拟—F1开始（enter enter）—检查正确—开启切割—调至程序—F11高频，F12锁定关闭—对刀—F12锁定打开—F1开始（enter enter）

2.2.3 磨金相组织

将小试样从200，400，600，800，1000，1200，1500，2000#砂纸上精磨线切割所留下的痕迹面，直至表面光亮无划痕，其它各表面在400#砂纸上粗磨一下即可。最后在精磨面的反

第二章 试验方法及原理

2.1实验过程

原材料 冷轧变形 线切割 表面处理 热处理 电解抛光 做标记 EBSD 10%变形 EBSD 退火处理 EBSD

2.2 样品制备

2.2.1实验材料

本工作的材料是纯度为99%以上呈紫红色光泽的金属铜块,外径尺寸为30毫米的正方

形。

2.2.2样品的变形方式 2.2.2.1 轧制（大变形）

原样品采用双辊轧机（外型如下图）轧制变形到厚度为4毫米的薄铜片，大变形约为86.7%

2.2.2.2 线切割

把轧制好的薄铜片在电火花线切割机上通过编程后自动切制成外径尺寸为4×4×11毫米的小样品。

1.缠丝，调整行程 2.装夹试样（注意角度）3.编程：绘图—直线—俩点直线—起点（0，0）—（x,y）—存盘—轨迹（0，0）—退出—Yes Yes—模拟—F1开始（enter enter）—检查正确—开启切割—调至程序—F11高频，F12锁定关闭—对刀—F12锁定打开—F1开始（enter enter）

2.2.3 磨金相组织

将小试样从200，400，600，800，1000，1200，1500，2000#砂纸上精磨线切割所留下的痕迹面，直至表面光亮无划痕，其它各表面在400#砂纸上粗磨一下即可。最后在精磨面的反

本科毕业论文（设计）

题 目

山东省单县鸡大肠杆菌病病原的分离-与鉴定及药敏试验

系 部 动物医学系 专 业 动物医学 年 级 2007级 学 号 222007602033167 姓 名 王亚 指 导 教 师 唐建华（副教授） 成 绩

2011年5月23日

目 录

任 务 书.............................................................................................................1 文献综述............................................................................