微生物细胞数目的测定方法

土壤微生物测定

土壤微生物活性表示土壤中整个微生物群落或其中的一些特殊种群状态，可以反映自然或农田生态系统的微小变化。土壤微生物活性的表征量有:微生物量、C/N、土壤呼吸强度和纤维呼吸强度、微生物区系、磷酸酶活性、酶活性等。

测定指标：

1、土壤微生物量 (Mierobia lBiomass，MB)

能代表参与调控土壤能量和养分循环以及有机物质转化相对应微生物的数量，一般指土壤中体积小于5Χ103um3的生物总量。它与土壤有机质含量密切相关。

目前，熏蒸法是使用最广泛的一种测定土壤微生物量的方法阎，它是将待测土壤经药剂熏蒸后，土壤中微生物被杀死，被杀死的微生物体被新加人原土样的微生物分解(矿化)而放出CO2，根据释放出的CO2:的量和微生物体矿化率常数Kc可计算出该土样微生物中的碳量。因此碳量的大小就反映了微生物量的大小。

此外，还有平板计(通过显微镜直接计数)、成份分析法、底物诱导呼吸法、熏蒸培养法(测定油污染土壤中的微生物量—碳。受土壤水分状况影响较大，不适用强酸性土壤及刚施用过大量有机肥的土壤等)、熏蒸提取法等，均可用来测定土壤微生物量。

熏蒸提取-容量分析法 操作步骤： （1）土壤前处理和熏蒸 （2）提取

将熏蒸土壤无损地转移到20

微生物学

微生物 (microorganism, microbe) 一词，是对所有形体微小、单细胞或个体结构较为简单的多细胞，甚至无细胞结构的低等生物的总称，或简单地说是对细小的、人们肉眼看不见的、只有借助于显微镜才能看见的生物的总称。但近年来发现有的细菌是肉眼可见的。

微生物特点：个体微小、结构简单、繁殖迅速、分布广泛、种类繁多、易变异 微生物的分离、纯化及培养技术

分离与纯化：从混杂的微生物群体中获得只含某一种或某一株微生物的过程。 为什么要进行纯培养：平板上的单一菌落并不一定保证是一种菌。

常用的分离、纯化方法： 单细胞挑取法 稀释涂布平板法 稀释混合平板法 平板划线法 稀释涂布平板法 ：

1、倒平板： 牛肉膏蛋白胨培养基，高氏I号培养基，查氏培养基冷却至55-60℃时，混匀后倒平板，牛肉膏蛋白胨培养基倒4皿，高氏I号培养基和查氏培养基各倒3皿。

2、制备污水稀释液：10g土样，加入90ml无菌水中，在三角瓶中振摇20min。取0.5ml 加入盛有4.5ml无菌水的试管中，以此类推，制成不同稀释度。 3、涂布：将上述每种培养基平板底面标记稀释度，然后用无菌吸管从最后三种稀释度，即10-4、10-5

土壤微生物生物量的测定方法

1土壤微生物碳的测定方法（熏蒸提取----仪器分析法）

1.1 基本原理

新鲜土样经氯仿熏蒸后（24h），土壤微生物死亡细胞发生裂解，释放出微生物生物量碳，用一定体积的0.5mol/LK2SO4溶液提取土壤，借用有机碳自动分析仪测定微生物生物量碳含量。根据熏蒸土壤与未熏蒸土壤测定有机碳的差值及转换系数（KEC），从而计算土壤微生物生物量碳。

1.2 实验仪器

自动总有机碳（TOC）分析仪（Shimadzu Model TOC—500,JANPAN）、真空干燥器、烧杯、三角瓶、聚乙烯熟料管、离心管、滤纸、漏斗等。

1.3 实验试剂

1）无乙醇氯仿（CHCL3）；

2）0.5mol/L硫酸钾溶液：称取87g K2SO4溶于1L蒸馏水中

3）工作曲线的配制：用0.5mol/L硫酸钾溶液配制10ugC/L、30ugC/L、50ugC/L、 70ugC/L、100ugC/L系列标准碳溶液。（其实一般情况下， 仪器会自带的标曲，一般不用自己做的）

1.4 操作步骤

1.4.1 土壤的前处理（过筛和水分调节略） 1.4.2 熏蒸

称取新鲜（相当

环境中微生物的检测

微生物体积小、重量轻，因此可以到处传播以致达到“无孔不入”的地步。微生物种类繁多，对外界环境的适应能力又很强，只要生活条件合适，它们就可以迅速繁殖起来。因此，它们是自然界分布最广的一群生物。无论是南极、北极、高山、海洋、陆地、淡水，还是土壤、空气、动植物体内外，几乎到处都有它们的踪迹。

空气、水是维持人类生命不可或缺的物质。它们直接进入人体或与人接触。如果带有病原微生物，将成为传染疾病的媒介。通过空气和水中微生物的检验，对环境质量进行控制。

1.1 土壤中的微生物

1.1.1 土壤是微生物生活的良好环境

在自然界，土壤是微生物生活的良好环境。因为土壤具有微生物生长繁殖所必需的各种环境条件。 1.1.1.1 营养

土壤中有大量动植物残体、植物根系的分泌物、人和动物的排泄物，这些有机物为微生物提供了良好的碳源、氮源和能源；土壤中丰富的矿质元素可以满足微生物对矿质营养的要求。 1.1.1.2 水分和渗透压

土壤中具有一定的持水性，可为微生物提供水分；土壤的渗透压对微生物是等渗或低渗环境，有利于微生物摄取营养。 1.1.1.3 空气

土壤团粒结构中的小孔隙充满空气，土壤中氧的含量比大气少，平均为土壤空气体积的7%-8%。通气良好的

微生物限度/无菌方法学验证流程

1.：提交单位购买申请菌种的购买：需要1.5个月

单位介绍信证明工作用途等文件，并向中检院网站提交申请，接到申请后一个月后中检院会把有

的菌种邮寄到使用单位，中检院菌种经常缺货并不是很齐全，不能一次买齐所需要的8种菌一次性买齐，

2. 每种从菌复活、分离、纯化复壮：共需要30天

药典规定进行药品检验所需8种标准阳性菌，购买中检院冻干菌粉后进行复活与保藏

1大肠埃希菌 2金黄色葡萄球菌 3枯草芽孢杆菌 4生孢梭菌 5铜绿假单胞菌 6沙门菌

（细菌每种冻干菌粉复活到分离纯化保藏各需要3-4天时间） 7白色念珠菌 8黑曲霉菌

（霉菌酵母菌冻干菌粉从复活到分离纯化制备孢子菌悬液需要至少7天时间）

3.培养基适用性/灵敏度验证：需要60-80天

实验中使用的培养基需要进行与中检院提供的标准培养基进行培养基适用性验证 每种培养基不同批号之间也需要进行验证之后方可以进行微生物检验用

药检室现有培养基种类20余种，每种培养基验证需要3-4天，完成所有培养基适用性验证需要60-80天。

恩替卡韦分散片微生物限度方法学适用性验证：

1. 回收率验证：回收率验证实验共需要26天

（若回收率达不

微生物细胞工程的应用

1.7 微生物细胞工程的应用1.7.1 通过原核微生物生产商品 1.7.2 现代生物农药 1.7.3 现代微生物肥料 1.7.4 生物净化与生物废料再生 1.7.5 微生物细胞固定技术

微生物细胞工程的应用

1.7.1 通过原核微生物生产商品将原核微生物改造成生产有用代谢产物的反应 将原核微生物改造成生产有用代谢产物的反应 器，生产许多重要的生物产品 细胞工程技术+基因工程技术， 细胞工程技术 基因工程技术，克隆生物产品 基因工程技术 的编码基因，在宿主细胞中进行表达。 的编码基因，在宿主细胞中进行表达。 降低成本，提高药效、 降低成本，提高药效、产量

微生物细胞工程的应用

技术策略目的基因的获得：基因组 文库， 目的基因的获得：基因组DNA文库，cDNA 文库 文库， 扩增， 文库，PCR扩增，化学合成法 扩增DNA/RNA提取，酶解，转化 提取，酶解， 提取 目的DNA的筛选：制作探针，从基因组 的筛选： 目的 的筛选 制作探针，从基因组DNA文 文 库或cDNA文库中筛选出目的 文库中筛选出目的DNA 库或 文库中筛选出目的探针制备：根据同源序列 纯化目的蛋白 纯化目的蛋白， 探针制备：根据同源序列/纯化目的蛋白，测定其氨

微生物限度/无菌方法学验证流程

1.：提交单位购买申请菌种的购买：需要1.5个月

单位介绍信证明工作用途等文件，并向中检院网站提交申请，接到申请后一个月后中检院会把有

的菌种邮寄到使用单位，中检院菌种经常缺货并不是很齐全，不能一次买齐所需要的8种菌一次性买齐，

2. 每种从菌复活、分离、纯化复壮：共需要30天

药典规定进行药品检验所需8种标准阳性菌，购买中检院冻干菌粉后进行复活与保藏

1大肠埃希菌 2金黄色葡萄球菌 3枯草芽孢杆菌 4生孢梭菌 5铜绿假单胞菌 6沙门菌

（细菌每种冻干菌粉复活到分离纯化保藏各需要3-4天时间） 7白色念珠菌 8黑曲霉菌

（霉菌酵母菌冻干菌粉从复活到分离纯化制备孢子菌悬液需要至少7天时间）

3.培养基适用性/灵敏度验证：需要60-80天

实验中使用的培养基需要进行与中检院提供的标准培养基进行培养基适用性验证 每种培养基不同批号之间也需要进行验证之后方可以进行微生物检验用

药检室现有培养基种类20余种，每种培养基验证需要3-4天，完成所有培养基适用性验证需要60-80天。

恩替卡韦分散片微生物限度方法学适用性验证：

1. 回收率验证：回收率验证实验共需要26天

（若回收率达不

微生物学假期综合教学实习

实习时间： 2013年 6 月 25 日 开始

实习班级： 应技1101-1102 人

生命科学技术学院微生物教研室

微生物教学实习基本实验流程

第 配制牛肉膏固体培养基、3倍和单倍乳糖发酵液， 一准备无菌水及各种器皿、器材 天

）

灭菌

采集样品

（

第按要求做10倍梯度稀释

二

天

）配制伊红美测样品的细菌总数： 乳糖培养基初发酵试验：

样品的稀释液涂布按实验要求将稀释液接入兰固体和E.C液 牛肉膏平板 3倍、单倍乳糖发酵培养液 体培养基

37OC培养 37OC培养 灭菌

数平板上菌落看乳酸发酵 倒伊红美兰平板 （数，计算样品的细结果，查MPN表 第菌总数 三 检验乳酸发酵管中产酸产气的样品天 ）

伊红美兰平板划线 接E.C管

37OC培养 44.5OC培养

（挑有金属光泽、看结果，鉴定是 第

无光泽的菌落 否有粪大肠杆菌 四

天接单倍乳糖发酵管 革兰氏染色 ）

37OC培养

看复发酵结果 （ 第 综合本实验的六项结果（细菌总数、乳糖管初发酵（MPN）、伊红美兰平板鉴定、 五E.C平板鉴定、革兰氏染色、乳糖复发酵），写出实验报告 天清洗器材，并做好室内清洁。 ） （

微生物学综合教学实习

学习目

第四章 病毒

1 病毒具有哪些特点？病毒壳体有哪几种对称类型？

答：①体积微小 ②无完整的细胞结构，主要成分是核酸跟蛋白质 ③严格活细胞内寄生 ④对干扰素敏感，对抗生素不敏感 ⑤繁殖方式是复制，且具有感染性；有螺旋对称型、二十面体对称型、复合对称型。

2 什么是病毒的一步生长曲线？包括几个期？各有何特点？

答：主要以烈性噬菌体为例，一步生长曲线是定量描述烈性噬菌体生长规律的曲线，反映了每种噬菌体的三个重要的特征参数：潜伏期、裂解期的长短及裂解量。包括潜伏期、裂解期和平稳期，潜伏期细胞正处于复制噬菌体核酸和合成蛋白质衣壳的阶段，裂解期宿主菌迅速裂解、溶液中噬菌体颗粒急速增加的阶段，平稳期宿主细胞已经全部裂解，溶液中噬菌体效价达到最高峰的时期。

3 以噬菌体为例，说明病毒的增殖过程。

答：①吸附和侵入：噬菌体感染细菌时，其尾部为吸附器官，能识别宿主菌表面的特殊受体，然后分泌酶类溶解细胞壁，使细胞壁出现小孔，讲头部的核酸注入宿主菌内，蛋白质外壳留在宿主菌细胞外；②生物合成：进入宿主菌内的噬菌体核酸，首先转录翻译产生早期蛋白，进行晚期转录并复制子代核酸，再转录产生噬菌体的结构蛋白，子代核酸和蛋白质按一定程序装配成完整的子代噬菌体颗粒；③当宿主菌细胞

第四章 病毒

1 病毒具有哪些特点？病毒壳体有哪几种对称类型？

答：①体积微小 ②无完整的细胞结构，主要成分是核酸跟蛋白质 ③严格活细胞内寄生 ④对干扰素敏感，对抗生素不敏感 ⑤繁殖方式是复制，且具有感染性；有螺旋对称型、二十面体对称型、复合对称型。

2 什么是病毒的一步生长曲线？包括几个期？各有何特点？

答：主要以烈性噬菌体为例，一步生长曲线是定量描述烈性噬菌体生长规律的曲线，反映了每种噬菌体的三个重要的特征参数：潜伏期、裂解期的长短及裂解量。包括潜伏期、裂解期和平稳期，潜伏期细胞正处于复制噬菌体核酸和合成蛋白质衣壳的阶段，裂解期宿主菌迅速裂解、溶液中噬菌体颗粒急速增加的阶段，平稳期宿主细胞已经全部裂解，溶液中噬菌体效价达到最高峰的时期。

3 以噬菌体为例，说明病毒的增殖过程。

答：①吸附和侵入：噬菌体感染细菌时，其尾部为吸附器官，能识别宿主菌表面的特殊受体，然后分泌酶类溶解细胞壁，使细胞壁出现小孔，讲头部的核酸注入宿主菌内，蛋白质外壳留在宿主菌细胞外；②生物合成：进入宿主菌内的噬菌体核酸，首先转录翻译产生早期蛋白，进行晚期转录并复制子代核酸，再转录产生噬菌体的结构蛋白，子代核酸和蛋白质按一定程序装配成完整的子代噬菌体颗粒；③当宿主菌细胞