实时荧光定量pcr利用

实时荧光定量PCR检测技术与其应用

微生物131 沈涛 201301220132

摘 要：实时荧光定量PCR（Real time quantitative polymerase chain reaction, RT-qPCR）是在PCR反应体系中加入荧光染料或荧光探针，利用荧光信号积累实时监测整个PCR反应进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点，被广泛应用于基础研究、疾病研究、病毒检测和食品安全检测等方面，是分子生物学研究中的重要工具。本文对RT-qPCR技术的原理、检测流程及其应用进行了综述。

关键词： RT-qPCR 原理 应用

1 背 景

RT-qPCR技术于1996年由美国Applied Biosystems公司推出，由于该技术不仅实现了PCR从定性到定量的飞跃，而且与常规PCR相比，它具有特异性更强、灵敏度高、重复性好、定量准确、自动化程度高、全封闭反应等优点成为分子生物学研究中的重要工具，能够实时检测记录PCR扩增产物的增加，克服了终点法定量PCR产物的不足，使准确定量RNA成为现实。然而受制于相关仪器、荧光

实时荧光定量PCR技术

1 样品RNA的抽提

①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。

②两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。

③RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。

⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。 ⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 2 RNA

实时荧光定量PCR技术

1 样品RNA的抽提

①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。

②两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。

③RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。

⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。 ⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 2 RNA

天为时代核酸系列讲座之院

华中科技大学同济医学

实时荧光定量PCR技术的原理及应用(Real time Quantitative PCR)北京天为时代科技有限公司 欧阳志荃 2005-05-20

讲 座 提 纲

实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量PCR医学和科研中的应用

实时荧光定量PCR定义

在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光 信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标 准曲线对未知模板进行定量分析的方法

实时荧光定量PCR 原理常 规 PCR技术：

实时原理

对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测 实时定量PCR技术： 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每 一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线 的分析对起始模板进行定量分析

实时荧光定量PCR原理如何对起始模板定量？

定量原理

通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析

介绍三个概念： 扩增曲线、荧光阈值、Ct值

实时荧光定量PCR 原理 ----------- 扩增曲线

荧光基团

荧光检测元件

扩增曲线图：横坐标：扩增循环数(Cycle);纵坐标：荧光强度 每个循环进行一次荧光信号的收集

实时荧光定量

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华中科技大学同济医学

实时荧光定量PCR技术的原理及应用(Real time Quantitative PCR)北京天为时代科技有限公司 欧阳志荃 2005-05-20

讲 座 提 纲

实时荧光定量PCR原理 实时荧光定量PCR的几种方法介绍 实时荧光定量PCR医学和科研中的应用

实时荧光定量PCR定义

在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光 信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标 准曲线对未知模板进行定量分析的方法

实时荧光定量PCR 原理常 规 PCR技术：

实时原理

对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测 实时定量PCR技术： 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每 一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线 的分析对起始模板进行定量分析

实时荧光定量PCR原理如何对起始模板定量？

定量原理

通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析

介绍三个概念： 扩增曲线、荧光阈值、Ct值

实时荧光定量PCR 原理 ----------- 扩增曲线

荧光基团

荧光检测元件

扩增曲线图：横坐标：扩增循环数(Cycle);纵坐标：荧光强度 每个循环进行一次荧光信号的收集

实时荧光定量

实时荧光定量PCR技术

1 样品RNA的抽提

①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。

②两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。

③RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。 ④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。

⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。 ⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。 2 RNA

实时荧光定量PCR系统 1、技术参数：

1.1、*样本通量（孔）：可支持2种模块（可选），96孔0.1ml模块、96孔0.2ml模块 1.2、*反应体系：96孔0.1ml模块：10-30uL ；96孔0.2 ml模块：10-100uL； 1.3、*温控模块最高升降温速率：6.5℃/秒 1.4、温度均一性：0.4℃

1.5、*精确数码温控模块：96孔0.1ml和0.2ml模块均支持3个独立的精确数码温控区域，一次实验可运行3个不同温度； 1.6、热循环系统：Peltier半导体 1.7、反应运行时间：<30分钟运行 1.8、线性动态范围：10 logs

1.9、分辨率：在单重反应中可区分1.5倍拷贝数差异 1.10、灵敏度：最低 1 拷贝

1.11、*支持的染料：FAM?/SYBR? Green, VIC?/JOE?/HEX?/TET?, ABY?/NED?/TAMRA?/Cy?3, JUN?, ROX?/Texas Red?，以上染料出厂前进行校正

1.12、*仪器自带存储：不小于10GB，（相当于2000-2500运行文件) 1.13、光源类型：高亮度白光半导体光源(工作寿命>5年)

1.14、*荧光通道数：96孔模块支持不少于4色激发光通道和4色检测光通道 1.15、光学激发检测范围：45

实时荧光定量PCR方法简介

一． 实时荧光定量PCR的基本原理

理论上，PCR过程是按照2n（n代表PCR循环的次数）指数的方式进行模板的扩增。但在实际的PCR反应过程中，随着反应的进行由于体系中各成分的消耗（主要是由于聚合酶活力的衰减）使得靶序列并非按指数方式扩增，而是按线性的方式增长进入平台期。因此在起始模板量与终点的荧光信号强度间没有可靠的相关性。如采用常规的终点检测法（利用EB染色来判断扩增产物的多少，从而间接的判断起始拷贝量），即使起始模板量相同经PCR扩增、EB染色后也完全有可能得到不同的终点荧光信号强度。

为了能准确判断样品中某基因转录产物（mRNA）的起始拷贝数，实时荧光定量PCR采用新的参数——Ct值，定量的根本原理是Ct值与样品中起始模板的拷贝数的对数成线性反比关系。

Ct值是如何得到的

在实时荧光定量PCR的过程中，靶序列的扩增与荧光信号的检测同时进行，定量PCR仪全程采集荧光信号，实验结束后分析软件自动按数学算法扣除荧光本底信号并设定阈值从而得到每个样品的Ct值。

Ct值的定义

Ct值中的“C”代表Cycle（循环），“t”代表检测threshhold（阈值），其含义是PCR扩增过程中荧光信号强度达到阈值所需要的循环数

实时荧光定量PCR原理和实验 所属分类: 基因检测 更多见 www.infobio.org 无论是对遗传病(如地中海贫血和血友病)、传染病(如肝炎和艾滋病)或肿瘤进行基因诊断，还是研究药物对基因表达水平的影响，或者监控药物和疗法的治疗效果，定量PCR技术都可以发挥很大作用。定量PCR技术的最新进展是实时荧光定量。该技术借助于荧光信号来检测PCR产物，一方面提高了灵敏度，另一方面还可以做到PCR每循环一次就收集一个数据，建立实时扩增曲线，准确地确定CT值，从而根据CT值确定起始DNA拷贝数，做到了真正意义上的DNA定量。这是DNA定量技术的一次飞跃。 根据最终得到的数据不同，定量PCR可以分为相对定量和绝对定量两种。典型的相对定量如比较经过不同方式处理的两个样本中基因表达水平的高低变化，得到的结果是百分比；绝对定量则需要使用标准曲线确定样本中基因的拷贝数或浓度。根据所使用的技术不同，荧光定量PCR又可以分为TaqMan探针和SYBR Green I荧光染料两种方法。比较而言，探针杂交技术在原理上更为严格，所得数据更为精确；荧光染料技术则成本更为低廉，实验设计更为简便。在选择实验方案时要根据实验目的和对数据精度的要求来决定。

ＰＣＲ 技术 业精于勤而荒于嬉 行成于思而毁于随

定量PCR技术

①传统终点定量法：为终点定量，重现性差、误差较大，只能作半定量、粗略定量

缺点：1、传统定量方法都是终点检测，即PCR到达平台期后进行检测，而PCR经过对数期扩增到达平台期时，检测重现性极差，

无法直接从终点产物量推算出起始模板量。加入内标后，可部分消除终产物定量所造成的不准确性。

2、在待测样品中加入内标，则PCR反应变为双重PCR，双重PCR反应中存在两种模板之间的干扰和竞争，尤其当两种模板的起始拷贝数相差比较大时，这种竞争会表现得更为显著，由于待测样品的起始拷贝数是未知的，所以无法加入合适数量的已知模板作为内标。

方法：以看家基因为内参，通过目的基因与看家基因扩增产物的电泳条带的灰度、宽窄、光密度比值来确定待测目的基因的表达量。

内参基因（看家基因）：在细胞中的表达量或在基因组中拷贝数恒定，受环境因素影响较小，用于对样本初始浓度差异进行均一化校正，常用的有β-actin、GAPDH、18sRNA等。

1）内参照法：在不同的PCR反应管中加入已定量的内标和引物，内标用基因工程方法合成。上游引物用荧光标记，下游引物不标记。在模板扩增的同