大肠杆菌感受态的意义

感受态细胞的制备

感受态大肠杆菌制备方法

四川大学生命科学学院

试剂配制：

A液：1M，MnCl2；mol/L

B液：1M，HEPES，pH=6.2-6.8，用无菌水配，配后不需灭菌；

C液：称取CaCl20.10g，KCl1.18g，全部转入细口试剂瓶，然后加入46ml三蒸水（一级水），轻轻振荡使所有组分充分溶解。将瓶塞盖上并用牛皮纸、棉线包扎，然后放入灭菌锅121℃高压灭菌备用。

TB缓冲液：

方法步骤：

1、溶液配制取1管B液（0.6ml），全部加入C液(46ml)中，混匀后，再用1ml移液器加

入3.3mlA液，混匀冰浴即可使用。

2、划线得到单菌落37℃培养箱培养过夜（约17h），挑取2-4个形态饱满的单菌落接种

于装有100mlSOB培养基的三角瓶,37℃剧烈振荡（300rpms）培养3-4小时,将培养温度调至18℃剧烈振荡（328rpms）培养，

3、其余与普通感受态差不多，每管加入4mlTB缓冲液，轻轻振荡，使菌体重新悬浮，

4、加入280mlDMSO（可用国产分析纯），混匀后分装入1.5mlEP管，冰上静置15分钟。

5、用纱布将所有装有感受态的EP管包好，用棉线系好后放入液氮中速冻，在液氮中静置12

小时以上

6、取出感受态放入-70℃超低温冰箱备用。

效率

感受态制备

A 大肠杆菌感受态的制备（CaCl2法）（《水稻NR和NIR基因启动子的克隆及功能验证》第38页）

1 材料、设备及试剂

1.1 材料

大肠杆菌DH5α、BL21、Rossette、JM109菌株

1.2试剂

LB液体培养基：

蛋白胨 10g/L

酵母提取物 5g/L

NaCl 10g/L

NaOH（1mol/L） 1mL/L

400mL 0.1M/L预冷的 CaCl2溶液（高温高压灭菌）

50%甘油

75%酒精

95%酒精

液氮

1.3 实验设备

接种环、酒精灯，打火机，75%酒精，95%酒精，50mL灭菌三角瓶4个，250mL灭菌的三角瓶4个，移液抢（5mL、200μL，1000μL），灭菌的枪头（5mL、200μL，1000μL），离心管（1.5mL，50mL）恒温摇床,灭菌锅，紫外分光光度计，超净工作台，制冰机，冰盒，高速冷冻离心机。

2 实验步骤

1、从新鲜培养的大肠杆菌DH5α平板上挑取一个单菌落，接种于5mL新鲜LB培液体养基中，于37℃，200rpm振荡培养过夜。

2、培养1

感受态制备

A 大肠杆菌感受态的制备（CaCl2法）（《水稻NR和NIR基因启动子的克隆及功能验证》第38页）

1 材料、设备及试剂

1.1 材料

大肠杆菌DH5α、BL21、Rossette、JM109菌株

1.2试剂

LB液体培养基：

蛋白胨 10g/L

酵母提取物 5g/L

NaCl 10g/L

NaOH（1mol/L） 1mL/L

400mL 0.1M/L预冷的 CaCl2溶液（高温高压灭菌）

50%甘油

75%酒精

95%酒精

液氮

1.3 实验设备

接种环、酒精灯，打火机，75%酒精，95%酒精，50mL灭菌三角瓶4个，250mL灭菌的三角瓶4个，移液抢（5mL、200μL，1000μL），灭菌的枪头（5mL、200μL，1000μL），离心管（1.5mL，50mL）恒温摇床,灭菌锅，紫外分光光度计，超净工作台，制冰机，冰盒，高速冷冻离心机。

2 实验步骤

1、从新鲜培养的大肠杆菌DH5α平板上挑取一个单菌落，接种于5mL新鲜LB培液体养基中，于37℃，200rpm振荡培养过夜。

2、培养1

大肠杆菌的培养

1. LB培养基配制： （液体培养基） ① 取1L的烧杯，加入适量的一蒸水（＜1000ml），称取胰蛋白胨 10g , 酵母提取物 5g , Nacl 10 g 倒入烧杯中

② 加入磁子搅拌，至完全溶解 ③ 用NaoH调PH=7.0，定容至1L ④ 分装后高压蒸汽灭菌 （固体培养基） ① 在液体培养基的基础上加入琼脂糖：1L液体培养基→15g琼脂糖（用水先溶解） ② 在电炉子上边加热边搅拌至煮沸溶解 ③ 分装后高压灭菌

抗生素的加入温度要求：高压灭菌后，将融化的LB固体培养基置与55℃的水浴中，待培养基温度降到55℃时（手可触摸）加入抗生素，以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。 注意事项：

① 电炉子温度不要太高，烧杯直接加热时电炉子上要加石棉网 高压灭菌时，瓶盖上要插上针头，防止灭菌时瓶盖喷出 2. 倒平板：

培养皿要提前进行灭菌、烘干，在超净工作台里，打开酒精灯，在酒精灯的火焰旁进行操作，倒完后做好标记

3. 接种（平板划线分离法）：

接种环挑取大肠杆菌进行接种：图式：

注意：每次划线前接种环都要灼烧灭菌，再冷却。 4. 37°恒温培养箱培养：

接种好的培养皿正置15分钟，然后倒置放入培养箱过夜培养

倒置培养原因：恒温

3.大肠杆菌电转化及电转感受态细胞的制备

电转化法是利用瞬间高压在细胞上打孔，同时，DNA在电场力的作用下进入细胞，随后

细胞复苏和弥合，从而实现质粒DNA的物理转移。为避免电击时出现“击穿”，即产生电

910

流，细胞悬浮液中应含有尽量少的导电离子。转化效率为10～10转化子/μg DNA。

3.1．感受态细胞的制备

（1）感受态细胞及材料准备同钙转化感受态细胞的制备相同。

（2）选合适的大肠杆菌在4℃，3000 rpm下离心10min，弃上清液（如需要，沉淀可在

4℃的10%甘油中保存1～2天）。

（3）弃上清，离心管中加入少量ddH2O，轻柔的悬浮沉淀后，再将水注满离心杯，4℃，3000

rpm离心10min。

（4）重复步骤（3）1次。

（5）小心弃上清（沉淀可能会很松散），再往离心管中加入少量10%甘油（灭菌，预冷），重悬菌体，再加满10%甘油，4℃，4000 rpm离心10min。

（6）用10%甘油重悬浮细胞至最终体积为2～3ml，将细胞按200μl等份装入微量离心管，放置于－80℃下保存。

（7）按照钙转化感受态细胞方法进行转化效率和抗性检测。

3.2．电转化

为了降低离子浓度，待转化的质粒

农杆菌感受态制备

1、划平板，单克隆培养

2、挑单克隆于5ML LB培养基中，摇到饱和（1-2day） 3、50m离心管中4500rpm，15min

4、50ml菌体用1ml氯化钙（预冷）悬浮，冰上操作 5、每100ul分装于冷冻管中，液氮速冻后，-70℃保存

农杆菌转化

1．50ul感受态+5ul质粒，放入液氮速冻2min 2．37℃ 热激5min

3. 加1mlLB，28℃培养3-4h

3. 8000rpm/min去上清，200ulLB悬浮，涂板吹干 农杆菌抗性：利福平+庆大霉素+载体抗性。（GV3101） 庆大霉素 40mg/ml （0.4g/10ml）；利福平 50mg/ml DMSO溶解 200ml LB + 200ul母液

农杆菌转植物

1. 植物去顶三天后转化，转前一天交足水

2. 摇菌OD600=1.2~1.6 （先小摇后，取200ul大摇200ml）

3. 室温5000rpm，15min，弃上清，悬浮于等体积渗透培养基中 （200ml/转化） 每1000ml渗透培养基：1/2 MS 2.42g；蔗糖50g；MES 0.5g；用1M KOH调PH到5.8/5.7，定容到1000ml，加10ul 1mg/ml6-BA，加200

EHA101农杆菌感受态细胞 编码 北京华越洋生物WXR15-100S 北京华越洋生物WWXR115-100 产名称 EHA101农杆菌感受态细胞 EHA101农杆菌感受态细胞 单位 规格 盒 盒 10*100ul 20*100ul

EHA101农杆菌感受态细胞

EHA101 Chemically Competent Cell 产品说明书 产品规格

EHA101: 10×100 μl

pK7WGF2 (control vector) 10 ng/μl 10 μl

保存条件： -80℃ 基因型

C58 (rif R) Ti pEHA101 (pTiBo542 D T-DNA) (kanR, strepR) Nopaline

EHA101农杆菌感受态细胞说明

华越洋 EHA101菌株为C58型背景，核基因中含有筛选标签——利福平抗性基因rif，为了便于转化操作，此菌株携带一无自身转运功能的胭脂碱型Ti质粒pEHA101 (pTiBo542DT-DNA)，此质粒含有vir基因 (vir基因是T-DNA插入植物基因组必需的元件，pEHA101

大肠杆菌及其检验

大肠杆菌的生物学特性

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简介：

大肠埃希氏菌习惯称为大肠杆菌，分类于肠杆菌科，归属于埃希氏菌属，并且大肠杆菌株ATCC 11775是该属的模式菌种。 附：肠杆菌科各属

大肠杆菌的不同菌株间DNA相关性为80%，而与同科的志贺氏菌属（除鲍氏志贺氏菌外）的DNA相关性可达80-87%。

大肠杆菌为人和动物肠道中的常居菌，一般多不致病，在一定条件下可引起肠道外感染。

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形态与染色

大小0.4～0.7×1～3um,无芽胞,大多数菌株有动力。

有普通菌毛与性菌毛，有些菌株有多糖类包膜，革兰氏阴性杆菌。 附：有动力是什么意思？请看动力试验。

革兰氏阴性杆菌是什么意思？请看革兰氏染色介绍。 大肠杆菌扫描电镜照片 大肠杆菌透射电镜照片 大肠杆菌分裂照片

最新： 大肠杆菌革兰氏染色照片

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培养特性

由于此菌合成代谢能力强，在含无机盐、胺盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。

最适生长温度为37℃，在42-44℃条件下仍能生长，生长温度范围为15-46℃。

在普通营养琼脂上生长表现3种菌落形态：

1

（1）光滑型： 菌落边缘整齐，表面有光泽、湿润、光滑、呈

大肠菌群测定的操作细则

大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。该菌主要来于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。 食品中大肠菌群数系以100mL(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。 1 设备和材料 1.1 温箱：36±1℃。 1.2 冰箱:0～4℃。

1.3 恒温水浴 :44.5±0.5℃。 1.4 天平。 1.5 显微镜。 1.6 均质器或乳钵。 1.7 平皿:直径为90mm。 1.8 试管。 1.9 吸管。

1.10 广口瓶或三角烧瓶:容量为500mL。 1.11 玻璃珠:直径约5mm。 1.12 载玻片。 1.13 酒精灯。 1.14 试管架。 2 培养基和试剂

2.1 乳糖胆盐发酵管:按GB 4789.28中4.9规定。 2.2 伊红美蓝琼脂平板:按GB 4789.28中4.25规定。

2.3 乳糖发酵管:按GB 4789.28中4.10规定。 2.4 EC 肉汤:按GB 4789.28中4.11规定。

2.5 磷酸盐缓冲稀释液:按GB 4789.28中3.22规定。 2.6 生理盐水。

维普资讯

畜牧兽压杂志

第 2卷】

第3 期

20 0 2年

肉鸡大肠杆菌病的诊治姚忠会(南省文山州农业学校 .南文山云云 630 ) 60 0

中图分类号：5 . 1 8 8 3

文献标识码： B

文章编号：0 4 6 0 (0 Z 0 0 30 1 0— 7 4 Z 0 ) 30 4 1

Z0 0 1年 3月，山县城郊某鸡场 2 0文 0 0多只 3 0

糖、麦芽糖、甘露醇，三糖铁产酸产气、不产生 H:不 s,液化明胶，尿素酶阴性，不利用拘木酸盐，基质试验阳性， .试验阳性， P试验阴性。 M R. V3 3动物试验 .

日龄艾维因肉鸡发生以呼吸困难、喘鸣、下痢为主要症状的疫情，日死亡 1 0多只。经诊断为大肠杆菌病现报道如下：

1发病情况该鸡群在 3 0日龄时发病病鸡主要表现精神萎顿，畏寒，挤堆，翅下垂，呼吸困难，喘鸣，食废绝，饮部分鸡拉灰黄色或灰绿色稀便。发病后 3d开始出现死 亡 .日死亡 1每 O多只， d时间就已死亡 8 1 5 0几只，且

用 2 4h普通肉汤培养物，腔接种 5只小白鼠，腹 同时用灭菌肉汤接种 2只小白鼠作为对照，剂量均为00 . Zm]只种后 4/接 8 h内， 5只试验小白鼠均死亡，

2只对照小白鼠均健活；剖检可见死亡鼠心外膜有点