测序峰图分析

测序常见峰图及原因说明

1.PCR产物电泳检测条带单一，为什么测序结果说模板杂？ 2. 什么是碱基缺失？ 3. 什么是引物不纯？

4. 重复结构对测序有哪些影响？ 5. 什么是模板不单一？

6. Poly结构的测序结果是怎样的？

7. 含有回文结构的模板测序结果是怎样的？ 8. 测序峰图为前双峰的结果是什么样的？ 9. 测序峰图为后双峰是什么样的？

10. 无信号的结果：信号值(ATGC的平均值)皆小于100

11. 飘峰：这是由于用3.0特殊试剂盒时碱基产生替代而出现碱基位移 12. 没有任何干扰的结果

Q-1.PCR产物电泳检测条带单一，为什么测序结果说模板杂？ 返回顶端 A-1.PCR产物电泳检测的结果只是一个粗略的定性结果。对于与目的片段条带大 小只相差几个碱基的非特异性PCR扩增产物是无法用肉眼区分开的。但是DNA测序反应敏感而客观，可以直接反应出模板本身的情况。需要强调的是，高质量的 PCR产物才可能得到高质量的测序结果，如果您对PCR产物的纯度不很确定，希望您可以将PCR产物进行克隆处理，以确保得到好的测序结果。以下图为例： 该反应的背景信号较高，不利于碱基的判读。 查看大图

解决办法：改变PCR条件，重新扩增。或者可以将该

人类基因组计划

一、HGP：人类基因组计划(Human Genome Project) 二、基因组测序 三、基因组分析

四、其他基因组的测序与分析

人的基因这么少，却能行使复杂的功能的原因： 1. 一个基因对应多个产物：可变剪切和蛋白修饰 2. 垃圾基因的功能：非蛋白编码基因的重要功能

任务与进展

完成四张图：遗传图谱、物理图谱、转录图谱、序列图谱

(一) 遗传图谱（Genetic map） 1. 定义

又称连锁图谱（linkage map)或遗传连锁图谱(genetic linkage map) ，是指人类基因组内基因以及专一的多态性DNA标记(marker)相对位置的图谱，其研究经历了从经典的遗传图谱到现代遗传图谱的过程。

2. 经典的遗传图谱（以基因表型为标记） 3. 现代遗传图谱（以DNA为标记）

多态性（polymorphism）：人的DNA序列上平均每几百个碱基会出现一些变异（variation），并按照孟德尔遗传规律由亲代传给子代，从而在不同个体间表现出不同，因而被称为多态性。

? 第一代多态性标记：限制性片段长度多态性-RFLP

? 第二代多态性标记：短的串联重复序列：小卫星DNA、微卫星DNA ? 第

测序常见问题及其分析 Collected by RobertoRun,12.10.2008

(From: http://biology.aweb.com.cn/news/2007/9/5/14270898.shtml)

HTUTU

UUTTH

1、PCR产物测序时出现重叠峰

问题图1（模板中有碱基缺失，往往是单一位点（1-1）或两个位点（1-2）碱基缺失导致测序结果移码）

图1-1

图1-2

解决方法：将PCR产物克隆到质粒（如T载体）中挑单克隆测序，或将PCR产物进行PAGE纯化（至少琼脂糖充分电泳后切胶纯化）后再进行测序。

问题图2（PCR产物不纯，含部分序列一致的两种以上的片段，长度不一）

图2

解决方法：主要原因是PCR产物没有纯化，含有部分序列一致的两种以上长度不一的片段，将PCR产物进行PAGE纯化（至少琼脂糖充分电泳后切胶纯化）后再进行测序，便可解决。

问题图3（测序引物有碱基缺失）

测序引物有碱基缺失（一般是引物的5'端缺失），和模板的碱基缺失即图1有些类似，所不同的是模板碱基缺失一般是在一段正常测序序列后才出现移码，而引物碱基缺失的话，则从测序一开始就出现移码，表面在图形上便是一开始就是严重的

测序常见问题及其分析 Collected by RobertoRun,12.10.2008

(From: http://biology.aweb.com.cn/news/2007/9/5/14270898.shtml)

HTUTU

UUTTH

1、PCR产物测序时出现重叠峰

问题图1（模板中有碱基缺失，往往是单一位点（1-1）或两个位点（1-2）碱基缺失导致测序结果移码）

图1-1

图1-2

解决方法：将PCR产物克隆到质粒（如T载体）中挑单克隆测序，或将PCR产物进行PAGE纯化（至少琼脂糖充分电泳后切胶纯化）后再进行测序。

问题图2（PCR产物不纯，含部分序列一致的两种以上的片段，长度不一）

图2

解决方法：主要原因是PCR产物没有纯化，含有部分序列一致的两种以上长度不一的片段，将PCR产物进行PAGE纯化（至少琼脂糖充分电泳后切胶纯化）后再进行测序，便可解决。

问题图3（测序引物有碱基缺失）

测序引物有碱基缺失（一般是引物的5'端缺失），和模板的碱基缺失即图1有些类似，所不同的是模板碱基缺失一般是在一段正常测序序列后才出现移码，而引物碱基缺失的话，则从测序一开始就出现移码，表面在图形上便是一开始就是严重的

转录组分析

研究背景：

RNA-Seq是通过结合实验和计算方法来鉴定生物样品中RNA序列的种类和丰度的一种技术。通过RNA-seq，我们就能够确定单链RNA分子中ATCG的顺序。整个过程主要包括：从细胞或组织中提取RNA分子、文库的构建以及后继的生物信息学数据分析。RNA-Seq技术具有许多早期研究方法（如：微阵列）所不具备的优点，如：RNA-Seq平台的高通量、新技术所带来的高灵敏度、发现新转录本、新基因模型以及非编码RNA的能力等。

RNA-Seq技术的到来，使人们认识到，无论是单细胞模式生物还是人类，我们对其转录组的认知异常匮乏。而RNA-Seq产生的新的数据，则可以帮助我们发现基因结构上的巨大差异、鉴定出新的转录本以及能够对small non-coding RNA和lncRNAs有着更好的了解。而且随着测序花费的降低，RNA-Seq的优势体现的更加明显。

服务流程：

样品选取

利用Oligo-dT富集mRNA

mRNA片段化

cDNA合成

末端修复、加polyA、加接头，PCR扩增

数据分析

测序方案：

内容：TotalRNA检测，普通转录组文库构建及测序及信息分析。 测序方式：H

高通量测序

高通量测序技术（High-throughput sequencing）又称“下一代”测序技术（\），以能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定和一般读长较短等为标志。 名词解释

根据发展历史、影响力、测序原理和技术不同等，主要有以下几种：大规模平行签名测序（Massively Parallel Signature Sequencing, MPSS)、聚合酶克隆（Polony Sequencing）、454焦磷酸测序（454 pyrosequencing）、Illumina (Solexa) sequencing、ABI SOLiD sequencing、离子半导体测序（Ion

semiconductor sequencing）、DNA 纳米球测序 （DNA nanoball sequencing）等。

高通量测序技术是对传统测序一次革命性的改变，一次对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，因此在有些文献中称其为下一代测序技术(next generation sequencing)足见其划时代的改变，同时高通量测序使得对一个物种的转录组和基因组进行细致全貌的分析成为可能，所以又被称为深度测序(deepsequencing

2018年基因测序行业市场发展分析报告

目录

测序技术： 不断更迭，性能不断提升 ................................................................................. 6

衡量测序的关键指标：读长、 通量、准确度和成本 ................................................. 6 一代测序技术： 金标准， 成本高难以大规模商业化应用 ....................................... 8 二代测序：高通量低成本，今后一段时期仍是主流 ................................................... 8 三代测序： 才露尖尖角， 科研界的大规模普及是首要里程碑 ............................... 9 测序策略的选择： 深度、 广度和数量的权衡 ......................................................... 13 测序上游产品篇： 大局已定，壁垒极高， 国产平台道阻且长 .......

高通量测序入门第一帖http://bbs.bioon.net/bbs/thread-368220-1-1.html 很高兴成为论坛特邀专家，鄙人会接下来的一段时间内写一些高通量测序数据方面的帖子，由浅入深，可能刚开始会比较简单一些，后面会有一些针对性的专题，也欢迎各位大侠或小菜提出建议或问题大家一起探讨。 为了活跃论坛建议大家直接跟帖或发新帖，我会尽快回复大家。

本人方向也仅限在RNA-seq 领域，所以其他领域的问题可能不太了解，只能按照自己的背景知识和请教别人解答，请大家慢拍砖！

另外，由于实验室课题比较忙，所以可能不能及时发帖或回复大家，也请见谅。

既然是入门专题，那就先简单说一下，要分析高通量测序数据的配置要求吧： 声明：该配置不适用与从华大拿回分析结果直接写paper 的同学。我认识的一位同学一点生物信息背景也没有，直接用华大返回分析结果发了很好的文章，如果想这样的同学可直接跳过这篇，等待以后的专题。 言归正传： 1. 软配置：

生物理论知识：熟悉生命活动的基本过程，对复制、转录、翻译、转录后修饰有较清晰的认识，如果知道cis-element 和 trans-factor 的区别就更好了。推荐朱玉贤的分子生物学，能够掌握60%

高通量测序入门第一帖http://bbs.bioon.net/bbs/thread-368220-1-1.html 很高兴成为论坛特邀专家，鄙人会接下来的一段时间内写一些高通量测序数据方面的帖子，由浅入深，可能刚开始会比较简单一些，后面会有一些针对性的专题，也欢迎各位大侠或小菜提出建议或问题大家一起探讨。 为了活跃论坛建议大家直接跟帖或发新帖，我会尽快回复大家。

本人方向也仅限在RNA-seq 领域，所以其他领域的问题可能不太了解，只能按照自己的背景知识和请教别人解答，请大家慢拍砖！

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既然是入门专题，那就先简单说一下，要分析高通量测序数据的配置要求吧： 声明：该配置不适用与从华大拿回分析结果直接写paper 的同学。我认识的一位同学一点生物信息背景也没有，直接用华大返回分析结果发了很好的文章，如果想这样的同学可直接跳过这篇，等待以后的专题。 言归正传： 1. 软配置：

生物理论知识：熟悉生命活动的基本过程，对复制、转录、翻译、转录后修饰有较清晰的认识，如果知道cis-element 和 trans-factor 的区别就更好了。推荐朱玉贤的分子生物学，能够掌握60%

华大智造测序仪与 illumina、life 测序仪比较

目前在病原微生物鉴定的检测领域，各家单位主要使用的测序仪器厂家和机型主要有华大智造（MGISEQ-200、MGISEQ-2000）、Illumina(Miseq、Nextseq 500 系列)和Life(Proton、S5)。

华大智造测序仪与illumina、life 相比较，优势主要体现在以下几个方面：测序原理和测序质量、仪器产能和灵活性、仪器在临床检测上的适用范围等几个方面，下面具体给老师展开介绍以下。

一、测序原理和测序质量

图 1：华大智造DNBSEQ TM 技术特点

华大智造测序仪采用领先的测序技术，DNBSEQ TM 技术主要包括DNA 单链环化和DNB 制备、规则阵列芯片、DNB 加载、cPAS 联合探针锚定聚合技术、双端测序技术、碱基识别算法等。DNBSEQ TM 具有高准确性、低重复序列率、低标签跳跃的重要特性（详见图1）。优势 1：扩增原理上相当于始终原始DNA 模板进行复制，有效避免了传统的PCR 测序方法中出现的复制错误积累，测序准确度更高。优势2：规则阵列芯片可以有效的避免测序时相邻DNB 之间荧光信号的干扰，测序质量更高，产出更稳定。优势3：华大智造测序仪基本无标签