鉴定蛋白质的实验过程

检测蛋白质与蛋白质之间相互作用的实验技术

一、检测蛋白质与蛋白质相互作用

① FRET技术（in vivo）

FRET，Fluorescence resonance energy transfer，即荧光共振能量转移技术。该技术的原理是用一种波长的光激发某种荧光蛋白后，它释放的荧光刚好又能激发另一种荧光蛋白，使其释放另一波长的荧光，如下图所示：

以下图为例，若要利用FRET检测两种蛋白是否有相互作用，需将两种蛋白的基因分别与这两种荧光蛋白的基因融合，并在细胞内表达出两种融合蛋白。然后只需用紫外光对CFP进行激发，并检测GFP是否放出绿色荧光。如果能检测到绿色荧光，那么可以说明这两种蛋白可能有相互作用；反之，则是这两种蛋白没有相互作用。

②酵母双、三杂交技术（in vivo）

酵母双杂交系统主要用于考察两种蛋白是否有相互作用，其原理是典型的真核生长转录因子，如GAL4、GCN4等都含有二个不同的结构域，即AD和BD。这些转录因子只有同时具有这两个结构域时才能起始转录。由此，设计不同的两个载体，一个含有AD基因（假设为A载体），另一个含有BD基因（假设为B载体）。

一般将一个已知蛋白的基因连在B载体上，作为诱饵(Bait)，将未知蛋白的基因连在A载体上，将这两

1、进行生命活动的主要能源物质 是( 糖类 ); 2、细胞中含量仅比水少的重要化 合物是( 蛋白质 ); 3、动物体内具储能和保温作用的 物质是( 脂肪 ); 4、植物细胞中重要的储能物质是 ( 淀粉 )。

实验：检测生物组织中 的糖类、脂肪和蛋白质应生10B 秦明丽 104120289

一、实验目的 尝试用化学试剂检测生物组织 中的糖类、脂肪和蛋白质。

如何检测(定性)?原理：某些化学试剂能够使生物组织中的有关有 机化合物产生特定的颜色反应。检测物质 还原性糖 脂肪 蛋白质 药品 现象

婓林试剂 浅蓝色—棕色—砖红色沉淀 苏丹III 苏丹IV 双缩尿 橘黄色 红色 无色—浅蓝色—紫色

淀粉

碘液

蓝色

斐林试剂与双缩脲试剂比较：斐林试剂: 甲液：质量浓度为0.1g/mL的NaOH溶液 乙液：质量浓度为0.05g/mL的CuSO4溶液 用法：甲乙液等量混合均匀后再注入。 试剂：双缩脲试剂： A液：质量浓度为0.1g/mL的NaOH溶液 B液：质量浓度为0.01g/mL的CuSO4溶液 用法：先加A液摇匀，再加B液摇匀。

一：检测生物组织中的还原糖(1)实验原理： 还原糖 + 斐林试剂→砖红色沉淀 (2)实验材料：苹果汁或梨匀浆 (3)试剂：斐林试剂 甲液：质量

班级：________________ 姓名：________________ 学号：________________ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _装_ _ _ _ _订_ _ _ _ _线_ _ _（装订线内禁止填写答案）_ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____ _ _____

一、单项选择题,（在备选答案中只有一个是正确的）(本大题共100小题,100分)

1. 维系蛋白质α-螺旋和β-折叠结构稳定的化学键是

A.氢键 B.离子键 C.二硫键 D.疏水作用 E.肽键

(4)氨基酸的疏水侧链很少埋在蛋白质分子的内部 A.1,2,3 B.1,3 C.2,4 D.4 E.1,2,3,4

11. 在电场中，蛋白质泳动速度取决于

A.蛋白质颗粒的大小 B.蛋白质颗粒的形状 C.带净电荷的多少

D.A+C

E.蛋白质所带电荷的多少，分子量的大小

一、 蛋白质的合成

1、 核糖体是合成蛋白质的机器，其功能是按照mRNA的指令由氨基酸合成蛋白质。 2、 游离核糖体游离于胞质中，合成细胞内的基础蛋白质；附着核糖体，附着在内质网

表面，构成粗面内质网的核糖体，合成分泌蛋白和膜蛋白。 3、 蛋白质合成的一般过程：

1）氨基酸的活化。氨基酸和tRNA在氨酰—tRNA合成酶作用下合成活化的氨酰—tRNA。2）起始、延伸和终止。3）蛋白质合成后的加工。肽链N端Met的去除；

氨基酸残基的化学修饰，乙酰化、甲基化、磷酸化等；肽链的折叠；二硫键的形成。

二、 蛋白质的分泌合成、加工修饰和转运

1、 信号肽介导分泌性蛋白在粗面内质网的合成。

1） 信号肽是蛋白质合成中最先被翻译出来的一段氨基酸序列，通常由18-30个疏

水氨基酸组成，能指引核糖体与内质网结合，并引导合成的多肽链进入内质网腔。

2） 新生分泌性蛋白质多肽链在胞质中的游离核糖体上起始合成。当新生肽链N端

的信号肽被翻译后，可立即被细胞质基质中的信号识别颗粒（SRP）识别、结合。

3） 与信号肽识别结合的SRP，识别结合内质网膜上的SRP-R，并介导核糖体锚泊

附着于内质网膜的通道蛋白移位子上。而SRP则从信号肽—核糖体复合体上解离，返回细胞质基质中重复

蛋白质的沉淀反应

一、目的和要求

1、加深对蛋白质胶体溶液稳定因素的认识 2、掌握几种沉淀蛋白质的方法 3、了解蛋白质变性与沉淀的关系 二、沉淀反应 （一）原理

在水溶液中，蛋白质分子的表面上由于有水化层和同性电荷的作用，所以成为稳定的胶体颗粒。但这种稳定的状态是有条件的。在某些理化因素的作用下，蛋白质分子表面带电性质发生变化、脱水甚至变性，则会以固态形式从溶液中析出，这个过程就称为蛋白质的沉淀反应。蛋白质的沉淀反应可分为以下两种类型：

1、可逆沉淀反应

沉淀反应发生后，蛋白质分子内部结构并没有发生大的或者显著变化。在沉淀因素去除后，又可恢复其亲水性，这种沉淀反应就是可逆沉淀反应，也叫做不变性沉淀反应。属于这类沉淀反应的有盐析作用、等电点沉淀以及在低温下短时间的有机溶剂沉淀法等。

2、不可逆沉淀反应

蛋白质在沉淀的同时，其空间结构发生大的改变，许多副键发生断裂，即使除去沉淀因素，蛋白质也不会恢复其亲水性，并丧失生物活性，这种沉淀反应就是不可逆沉淀反应。重金属盐、生物碱试剂、强酸、强碱、加热、强烈震荡、有机溶剂等都能使蛋白质发生不可逆沉淀反应。

（二）盐析 1、材料与试剂

（1）10%的卵清蛋白溶液（要求新鲜配制）、浓蛋白溶液（2）饱和硫酸铵

牛乳蛋白质的 提取与鉴定

一、实验目的： 了解蛋白质的化学性质； 掌握蛋白质的提取方法和鉴定理。

二、实验原理： 牛乳中含丰富的蛋白质(水分87.8%、脂 肪3.5%、蛋白质3.1%、乳糖4.9%、灰分 0.7%、能量29.kg/100kg),其中主要是

酪蛋白。酪蛋白在牛乳中约占总蛋白量的5/6。

1、酪蛋白提取的原理 蛋白质是含羧基和氨基的两性电解质，在某 一pH值溶液中，蛋白质分子所带的正电荷和 负电荷相等，蛋白质以两性离子状态存在， 这时溶液的pH值，称为该蛋白质的等电点 (PI)。 在等电点时，蛋白质所带净电荷为零， 溶解度最小，蛋白质沉淀析出，利用蛋白质 的这个特点可将蛋白质提取出来。 由于粗提出的酪蛋白中还含有脂肪，可 用乙醇和乙醚洗涤除去。

2、酪蛋白鉴定的原理 酪蛋白中含有酪氨酸残基，酪氨酸残基 的R基团为：

含酚羟基，可与米伦试剂反应先生成白色絮状沉淀，继续反应生成红色沉淀。

酪蛋白中还含有含硫氨基酸(胱氨酸、半胱氨酸和蛋氨酸),在碱性溶液中水解后可与醋酸

铅反应生成黑色的硫化铅。

三、操作步骤

(一)酪蛋白的制备新鲜牛奶、醋酸纳缓冲液各5ml 40℃

分别加热至同样温度

上清液：保留做鉴定(烧杯)(三)2000r/m

第五章 蛋白质（Protein) 本章主要内容（Content）

蛋白质的一般性质（General aspects)

■ 结构 ■ 蛋白质-水相互作用，影响蛋白质水溶性的因素 ■ 蛋白质-脂的相互作用 蛋白质的变性（Denaturation）

■ 蛋白质变性产生的效应 ■ 导致蛋白质变性的物理因素 ■ 导致蛋白质变性的化学因素

蛋白质的功能性质（Functional Properties） 定义与分类

水化性质 溶解度与粘度、凝胶作用

组织化 热凝结和形成、纤维的形成热塑挤压、面团 乳化性质 乳化能力与乳化稳定性 起泡作用 起泡性与泡沫稳定性 ?蛋白质的营养特性（Nutritional properties） ?蛋白质的开发利用（Utilization）

植物蛋白质和动物蛋白质：浓缩蛋白质与分离蛋白质利用微生物生产蛋白质——单细胞蛋白 第一节 引言（Introducti

■ 蛋白质是构成生物体的基本物质。

病毒，细菌，激素，植物和动物细胞原生 质都是以蛋白质为基

1

础的。

■ 酶是蛋白质 已经发现数以千计的酶。 ■ 蛋白质是由20种氨基酸构成的聚合物 一、蛋白质的分类： （一）根据组成分类

? 简单蛋白质（

蛋白质 (Protein)

组成（Composition）

?生物大分子（Macromolecule） ?构件分子—氨基酸 (Amino acid)

氨基酸 (Amino acids) R—基团

对氨基酸性质影响强烈

?非极性、疏水性。 ?极性、电中性。

?极性、负电荷、碱性。 ?极性、正电荷、酸性。

水溶液中的氨基酸 两性电解质

水溶液中的氨基酸 酸性氨基酸

水溶液中的氨基酸 碱性氨基酸

分类（Classification）

?非极性、疏水性的 ?极性、电中性的

?极性、带负电荷、碱性的 ?极性、带正电荷、酸性的

?植物蛋白与动物蛋白在氨基酸组成上

的差异——

?人体必须氨基酸——

8种氨基酸

?蛋白质的生物学效价（PER） ?转基因植物蛋白

?各种氨基酸配比的蛋白食品

一级结构（Primary structure）

?氨基酸——氨基+羧酸基 ?肽键(Peptide bond)

一级结构（Primary structure）

?线性结构(Linear polymer of amino

acids) ?氨基酸序列（Sequence）——蛋白质分子

?氨基末端（N-terminal） ?羧酸基末端（C-terminal）

?氨基酸残基(Amin

实验八、蛋白质含量的测定

教学目的要求： 基本知识点

?1、掌握凯氏定氮法（Kjedahl法）测定蛋白质的原理、基本过程和操作关键。

?2、熟练消化、蒸馏、称量、过滤、定容、滴定等基本操技术。 ?3、掌握龙科－A型K氏定氮仪的操作方法 ?4、掌数据处理和结果计算技术。

重点

?1、熟练消化、蒸馏、称量、过滤、定容、滴定等基本操技术。 ?2、掌握龙科－A型K氏定氮仪的操作方法 难点

凯氏定氮法（Kjedahl法）测定蛋白质的原理、基本过程和操作关键。 课时教学方案： 复习与提问：

?1、检查实验准备情况，

?（1）实验内容；

?（2）实验仪器与试剂有哪些？

?（3）凯氏定氮法（Kjedahl法）测定蛋白质程序。 ?2、凯氏定氮法（Kjedahl法）测定蛋白质的原理。 ?3、样品消化时应注意的事项。

?4、龙科－A型K氏定氮仪的工作原理与蒸馏操作方法。

实验八、蛋白质含量的测定

一、实验目的

1、掌握凯氏定氮法测定蛋白质的原理；

2、熟悉凯氏定氮法中样品的消化、蒸馏、吸收等基本操作技能； 3、熟练称量、溶液转移、滴定等基本操作技能。 二、实验原理

食品与硫酸和催化剂一起加热消化，使蛋白质分解，其中C、H形成CO2

及H20逸去而氮以氨的形式与硫酸

1- 蛋白质化学

名词解释

（一） 两性离子（dipolarion）与两性化合物 （二） 等电点(isoelectric point,pI)与等离子点 （三） 必需氨基酸（essential amino acid） （四） 稀有氨基酸(rare amino acid)

（五） 非蛋白质氨基酸(nonprotein amino acid) （六） 构型(configuration)与构象(conformation) （七） 肽键、肽平面、肽单位、多肽 （八） N末端与C末端

（九） 蛋白质的一级结构(protein primary structure) （十） 蛋白质的二级结构(protein secondary structure) （十一） 蛋白质的α－螺旋结构 （十二） 蛋白质的β－折叠结构 （十三） 结构域(domain)

（十四） 超二级结构(super-secondary structure) （十五） 蛋白质的三级结构(protein tertiary