纤维素酶的发酵方法

*33*年第"-期中国饲料

—*-—

纤维素酶酶活的测定方法

河南省科学院生物研究所河南省饲料产品质量监督检验站

刘德海陈小鸽

杨玉华

安明理

饲用纤维素酶在饲料工业中已普及应用，对其质量检测显得日益重要。纤维素酶是一种复合酶，按作用底物的能力划分为两部分，一部分是对棉花纤维素能起催化水解作用的酶，称为!"酶；另一部分是对羧甲基纤维素钠（#$%!&!）起水解作用的酶，称为!’酶。据此，一般采用两种测定方法，一种是适用于!(酶的!&!法，另一种是适用于!"酶的滤纸法。下面就此两种方法作一介绍。

"

!&!（羧甲基纤维素）法")"材料")")"饲用纤维素酶由河南省科学院生物研

究所提供。

")")*试剂磷酸氢二钠、

柠檬酸、羧甲基纤维素、+，,%二硝基水杨酸、氢氧化钠、酒石酸钾钠、亚硫酸钠、苯酚。")")+仪器

-*"型分光光度计、

恒温水浴锅、./0%*酸度计、

秒表。")")1

试剂配制")")1)"2/,)3柠檬酸缓冲液制取3)*45678

磷酸氢二钠液（称取-)

*33*年第"-期中国饲料

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纤维素酶酶活的测定方法

河南省科学院生物研究所河南省饲料产品质量监督检验站

刘德海陈小鸽

杨玉华

安明理

饲用纤维素酶在饲料工业中已普及应用，对其质量检测显得日益重要。纤维素酶是一种复合酶，按作用底物的能力划分为两部分，一部分是对棉花纤维素能起催化水解作用的酶，称为!"酶；另一部分是对羧甲基纤维素钠（#$%!&!）起水解作用的酶，称为!’酶。据此，一般采用两种测定方法，一种是适用于!(酶的!&!法，另一种是适用于!"酶的滤纸法。下面就此两种方法作一介绍。

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!&!（羧甲基纤维素）法")"材料")")"饲用纤维素酶由河南省科学院生物研

究所提供。

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柠檬酸、羧甲基纤维素、+，,%二硝基水杨酸、氢氧化钠、酒石酸钾钠、亚硫酸钠、苯酚。")")+仪器

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磷酸氢二钠液（称取-)

实验二、黑曲霉发酵生产纤维素酶大实验

一、实验目的

1、了解纤维素酶的生产工艺和原理 2、掌握液体发酵和固体发酵工艺

3、学会DNS法测定还原糖含量的方法和原理 二、实验原理

纤维素酶可以用于一切含纤维素的生物质的降解，具有广阔的应用前景。高产纤维素酶的微生物主要有木霉属、曲霉属、根霉属，黑曲霉所产的纤维素酶中β-葡萄糖苷酶活力高，能避免酶解产物纤维二糖的阻遏作用，而且安全无毒，故而成为生产纤维素酶的主要菌种之一。纤维素酶是诱导酶，故发酵生产时需有纤维素物质作诱导剂。

以羧甲基纤维素钠作底物，用发酵所得纤维素酶对底物进行酶解，测定酶解液中的还原糖含量（以葡萄糖计），可以计算酶活力高低。还原糖与DNS反应形成棕色物质，颜色深浅与糖含量成正比。 三、材料与试剂配制

1、生产菌种：黑曲霉

2、斜面（活化）培养基：酵母膏0.4%，蛋白胨0.6%，可溶性淀粉1%，葡萄糖0.9%，马玲薯浸出液7%，琼脂2%，陈海水（或人工海水）配制，pH7.0-7.4。

3、人工海水：NaCl = 24 g/L ;MgSO4·7H2 O = 7.0 g/L ;NH4NO3 = 1 g/L ;KCl = 0.7 g/ L ; NaH2PO4 = 2.0 g/ L ;N

*33*年第"-期中国饲料

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纤维素酶酶活的测定方法

河南省科学院生物研究所河南省饲料产品质量监督检验站

刘德海陈小鸽

杨玉华

安明理

饲用纤维素酶在饲料工业中已普及应用，对其质量检测显得日益重要。纤维素酶是一种复合酶，按作用底物的能力划分为两部分，一部分是对棉花纤维素能起催化水解作用的酶，称为!"酶；另一部分是对羧甲基纤维素钠（#$%!&!）起水解作用的酶，称为!’酶。据此，一般采用两种测定方法，一种是适用于!(酶的!&!法，另一种是适用于!"酶的滤纸法。下面就此两种方法作一介绍。

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!&!（羧甲基纤维素）法")"材料")")"饲用纤维素酶由河南省科学院生物研

究所提供。

")")*试剂磷酸氢二钠、

柠檬酸、羧甲基纤维素、+，,%二硝基水杨酸、氢氧化钠、酒石酸钾钠、亚硫酸钠、苯酚。")")+仪器

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恒温水浴锅、./0%*酸度计、

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磷酸氢二钠液（称取-)

生物化学实验报告

题目：纤维素酶活力的测定（3,5-二硝基水杨酸法）

姓名： 学号： 班级： 时间：

一、

实验目的：

掌握还原糖的测定原理，学习用3,5-二硝基水杨酸法测定还原糖的方法。

二、

实验原理：

纤维素酶水解纤维素，产生纤维二糖、葡萄糖等还原糖，能将3,5-二硝基水杨酸中硝基还原成橙黄色的氨基化合物，利用比色法测定其还原物生成量来表示酶的活力。 三、

实验试剂：

1. 3,5-二硝基水杨酸显色液：称取10g 3,5-二硝基水杨酸，溶入蒸馏水中，

加入20g分析纯氢氧化钠，200g酒石酸钾钠，加水500ml，升温溶解后，加入重蒸酚2g，无水亚硫酸钠0.5g。加热搅拌，待全溶后冷却，定容至1000ml。存于棕色瓶中，放置一周后使用。 2. 0.1摩尔pH4.5乙酸-乙酸钠缓冲溶液。

3. 0.5%羧甲基纤维素钠水溶液，溶解后成胶状液，静置过夜。使用前摇匀。 4. 标准葡萄糖溶液：称取干燥至恒重的葡萄糖100mg，溶解后定容至100ml，

此溶液含葡萄糖1.00mg/ml。

5. 酶液：将0.05g酶溶解定容至50ml，从中取出1ml再定容至100ml，待

测。（用pH4.5乙酸-乙酸钠缓冲溶液配制）

四、

目 录

实验一 产纤维素酶菌种的分离与初筛 实验二 产纤维素酶菌种的复筛与保藏 实验三 酶活测定与传代保藏

实验四 产纤维素酶菌种的紫外诱变育种 实验五 产纤维素酶菌种的产酶条件优化

实验六 产纤维素酶菌种的产酶条件优化的结果分析

实验一 产纤维素酶菌种的分离与初步鉴定

一、实验目的

1．了解产纤维素酶微生物分离的基本原理； 2．掌握产纤维素酶微生物分离的操作方法。

二、实验原理

自然界中存在大量的纤维素类物质，同时存在着很多能分解纤维素类物质的生物，小到

细菌、放线菌、真菌，大到一些食草类昆虫与动物。这些生物与绿色植物一起构成了这个世界的碳循环。在发酵堆肥中，存在着大量的，耐高温的纤维素分解菌株，但多半都为混合分解，菌种需要：

1. 内切型葡萄糖苷酶（endo-1,4-β-D-glucanase,EC3.3.1.4,简称EBG），也称Cx酶、CMC

酶、EG。这类酶作用于纤维素分子内部的非结晶区，随机识别并水解β-1,4-糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量非还原性末端的小分子纤维素； 2. 外切型葡萄糖苷酶（exo-1,4-β-D-glucanase,EC3.2.1.91），也称C1酶、微晶纤维素酶、

纤维二糖水解酶（Cell

纤维素酶对甜高梁秸秆发酵产酒率影响的研究

第７期（总第１７８期）

农产品加工 学刊

Ｎｏ．７２００９年７月

ＡｃａｄｅｍｉｃＰｅｒｉｏｄｉｃａｌｏｆＦａｒｍＰｒｏｄｕｃｔｓＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇ

Ｊｕｌ．

文章编号：１６７１—９６４６（２００９）０７－００１０－－０３

纤维素酶对甜高梁秸秆发酵产酒率影响的研究

再吐尼古丽 库尔班ｔ，’叶

凯１，涂振东１，冯国郡１，傅

力２

（１．新疆农业科学院。新疆乌鲁木齐８３００９１；２．新疆农业大学食品学院，新疆乌鲁木齐８３００５２）

摘要：采用同态发酵法，进行了生产燃料乙醇的试验，同时尽量在相同条件下，研究了纤维素酶对甜高粱秸秆发酵

产酒率的影响。实验分２组。第１组为空白试验：酵母菌接种量为０．２％，发酵温度２８℃。第２组为对照试验：酵

母菌接种量为０．２％，发酵温度２８℃，纤维素酶０．８％，发酵时间为１１４

ｈ。结果表明，第１组折算。甜高粱茎秆发酵

产酒，体积分数为６ｌ％的乙醇得率为３．５倒，１００ｇ；第２组折算，体积分数为６１％的乙醇得率为６．５６ｇ，１００ｇ，比不加

纤维素酶的乙醇得率提高了３．０６％。

关键词：甜高粱秸秆；固态发酵；纤维素酶中图分类号：ＴＱ９２０．６

文献标志码：Ａ

ｄｏｉ：１０ ３９６９１ｊｉｓｓｎ １６７１—９６４６

从微生物纤维素酶的来源、性质、分子结构及作用机理等四个方面详细概述了国内外微生物纤维素酶及其降解纤维素机理的研究现状,并提出微生物纤维素酶降解纤维素的研究方向,对今后在微生物纤维酶及其降解机理方面的进一步研究有重要的指导意义。

8 6

陕

西

农

业

科

学

21() 0 0 3

农艺探讨

微生物纤维素酶及其降解纤维素机理的研究进展王翮

(安职业技术学院生物工程系，西西安西陕摘

7 07 ) 1 0 7

要：微生物纤维素酶的来源、质、子结构及作用机理等四个方面详细概述了国内外微生物纤维素酶从性分

及其降解纤维素机理的研究现状，并提出微生物纤维素酶降解纤维素的研究方向，今后在微生物纤维酶及对

其降解机理方面的进一步研究有重要的指导意义。关键词：生物纤维素；纤维素酶；降解微

纤维素是地球上最丰富的多糖化合物，泛广存在于如树杆等植物中，全世界每年生产的纤维素及半纤维素总量在 8 0亿 t] 5[。将纤维素水解 1为小分子单糖，糖再通过微生物发酵生产各种单有用的产品，藉此有望有效利用这些源源不断的

酶一般最适 p为中性至偏碱性，且对天然纤 H并维素的水解作用较弱L。在草食动物的消化 6]道，特别是反刍动物的瘤胃中也存在一些可以分

解纤维素的细菌类群。一些类群的放线菌也可以产生纤维素

万方资料

第27卷第3期2005年6月江西农业大学学报

ActaAgriculturaeUniversitatisJiangxiensis

Vol.27,No.3June,2005

文章编号:1000-2286(2005)03-0466-03

黑曲霉LH2446产纤维素酶液体

发酵条件的研究

汪世华

1,2

,胡开辉,黄碧芳,余文英,彭利民

2223

　　(1.福建农林大学生物农药与化学生物学教育部重点实验室,福建福州350002;2.福建农林大学生命科学院开放实验室,福建福州350002;3.武汉隆华生物股份有限公司技术中心,湖北武汉430000)

摘要:采用诱变后的黑曲霉LH2446液体发酵生产纤维素酶。确立了产酶最佳条件:5%稻草粉为碳源,1%的黄豆粉为氮源,培养基起始pH值为pH6.5,250mL三角瓶中装培养基75mL,培养时间为h,温度为30℃。在最适条件下产纤维素酶的最高产量为23600U/g。关键词:纤维素酶;液态发酵;产酶条件中图分类号:Q55　　文献标识码:A

StudiesonsforSubmergedFermentation

ofnigerLH2446toProduceCellulase

WANGShi-hua

2

1,2

,HUKai-hui

2

2

3

HU

纤维素酶对甜高梁秸秆发酵产酒率影响的研究

第７期（总第１７８期）

农产品加工 学刊

Ｎｏ．７２００９年７月

ＡｃａｄｅｍｉｃＰｅｒｉｏｄｉｃａｌｏｆＦａｒｍＰｒｏｄｕｃｔｓＰｒｏｃｅｓｓｉｎｇ

Ｊｕｌ．

文章编号：１６７１—９６４６（２００９）０７－００１０－－０３

纤维素酶对甜高梁秸秆发酵产酒率影响的研究

再吐尼古丽 库尔班ｔ，’叶

凯１，涂振东１，冯国郡１，傅

力２

（１．新疆农业科学院。新疆乌鲁木齐８３００９１；２．新疆农业大学食品学院，新疆乌鲁木齐８３００５２）

摘要：采用同态发酵法，进行了生产燃料乙醇的试验，同时尽量在相同条件下，研究了纤维素酶对甜高粱秸秆发酵

产酒率的影响。实验分２组。第１组为空白试验：酵母菌接种量为０．２％，发酵温度２８℃。第２组为对照试验：酵

母菌接种量为０．２％，发酵温度２８℃，纤维素酶０．８％，发酵时间为１１４

ｈ。结果表明，第１组折算。甜高粱茎秆发酵

产酒，体积分数为６ｌ％的乙醇得率为３．５倒，１００ｇ；第２组折算，体积分数为６１％的乙醇得率为６．５６ｇ，１００ｇ，比不加

纤维素酶的乙醇得率提高了３．０６％。

关键词：甜高粱秸秆；固态发酵；纤维素酶中图分类号：ＴＱ９２０．６

文献标志码：Ａ

ｄｏｉ：１０ ３９６９１ｊｉｓｓｎ １６７１—９６４６