质粒与载体正向和反向连接

质粒与载体

点击次数：442 发表于：2008-07-08 17:32　转载请注明来自丁香园
来源：互联网


一、质粒

绝大多数的生物都是以DNA 的形式来储藏其遗传信息。遗传物质要能生生不息地传给后代的首要条件就是它至少要具有一个复制原(ori, origin of replication，或译为复制起点)，使整个基因体得以复制。含有复制原的遗传物质称为replicon，我们姑且把它译为为复制体吧！原核性复制体分为原核染色体、质粒(plasmids)和噬菌体基因体(phage genome)等三类。其中质粒的基因体和原核染色体类似，是由双绞炼DNA 构成，并以超卷曲的形式存在。它们的基因体约由2,000至150,000个碱基对组成，绝大多数呈环状，但也有极少数是线状构造(如Borrelia burgdorfferi)。事实上你可以把它们视为比较小的原核染色体。在自然环境中它们相当普遍地生存在原核生物细胞内，并和其宿主的许多特殊功能有关，诸如：赤贺氏杆菌(Shigella)的抗药、根瘤菌(Rhizobium)的固氮、农杆菌(Agrobacterium)的引瘤及假单胞杆菌(Pseudomonas)对环状有机物的分解等等。以下我们谈的以细菌性质粒为主，

基因克隆的质粒载体

在大肠杆菌的各种菌体中找到了许多种不同类型的质粒，其中已经作了比较详尽研究的主要有F质粒、R质粒和Col质粒。

①F质粒 又叫F因子或性质粒（sex plasmid）。它们能够使寄主染色体上的基因和F质粒一道转移到原先不存在该质粒的受体细胞中去。

②R质粒 通称抗药性因子。它们编码有一种或数种抗菌素抗性基因，并且通常能够将此种抗性转移到缺管该质粒的适宜的受体细胞，使后者也获得同样的抗菌素抗性能力。

③Col质粒 即所谓产生大肠杆菌素因子。它们编码有控制大肠杆菌素合成的基因。大肠杆菌是一类可以使不带有Col质粒的亲缘关系密切的细菌菌株致死的蛋白质。

第一节 质粒的一般生物学特性

一、质粒DNA

细菌质粒是存在于细胞质中的一类独立于染色体的自主复制的遗传成份。绝大多数的质粒都是由环形双DNA组成的复制子（图4-1）。

1

质粒DNA分子可以持续稳定地处于染色体外的游离状，但在一定的条件下又可逆地整合到寄主染色体上，随着染色体的复制而复制，并通过细胞分裂传递到后代。

环形双链的质粒DNA分子具有三种不同的构型：

1．当其两条多核苷酸链均保持着完整的环形结构时，称之为共价闭合环形DNA（cccDNA），

实验一、碱裂解法提取质粒DNA和质粒DNA的纯化

一、实验目的

学习并掌握基因工程操作技术中最常用的载体质粒DNA的提取方法和进一步的纯化技术。

二、实验原理

在碱性溶液中，双链DNA氢键断裂，DNA双螺旋结构遭破坏而发生变性，但由于质粒DNA分子量相对较小，且呈环状超螺旋结构，即使在高碱性pH条件下，两条互补链也不会充分分离，当加入中和缓冲液时，变性质粒DNA又恢复到原来的够型；而线性的大分子量细菌染色体DNA则不能复性，与细胞碎片、蛋白质、SDS等形成不溶物，通过离心沉淀可被除去，而质粒DNA及小分子量的RNA则留在上清液中。混杂的RNA可用RNaseA酶消除，再用酚/氯仿处理，可除去残留的蛋白质，达到纯化质粒DNA的目的。

三、实验材料

大肠杆菌DH5α（含重组了约800bp DNA片断的pMD18-T质粒，Amp抗性）

四、实验仪器、用具

高压灭菌锅、超净工作台、恒温摇床、台式离心机、涡旋振动器、培养管、移液器、离心管、吸管头、量筒、紫外观测仪

五、实验试剂

LB培养基、3mol/L醋酸钠（pH5.2）、TE缓冲液（pH8.0）、无水乙醇、75%乙醇、RNaseA（10mg/ml）、goldview DNA染色剂、氯仿、琼脂糖 抽提质粒DNA所需的溶液：

目的基因与载体连接、 感受态制备及转化

【实验原理】

1；酶促生物化学反应过程

在一定的条件下，由DNA连接酶催化目的基因与载体相邻的5’端磷酸与3’端羟基之间形成磷酸二酯键的过程。相同或不同的限制性内切酶产生相同的粘性末端，在降至退火温度时，能重新互补结合，在DNA连接酶的催化下，目的基因与载体相连接。 2；DNA连接酶的分类：

T4 DNA连接酶：催化dsDNA粘末端连接及平端连接

大肠杆菌DNA连接酶：不能催化平末端连接,其底物只能是带缺口的双链DNA分子和具同源互补粘末端的不同DNA分子

3；T4 DNA连接酶：来源 T4噬菌体感染的大肠杆菌

最佳pH值 7.2～7.8，常用的反应液为pH7.6 的Tris-HCl缓冲液 需ATP，Mg2+参加反应

二硫苏糖醇等巯基化合物可促进连接酶的连接 作用；高浓度的Na+、K+等抑制酶的活性。

4；受体分类：受体细胞也称为宿主，是重组子扩增及表达的场所，分为原核细胞和真核细

胞两类。

5；应用：原核细胞：重组子复制扩增，外源基因表达系统 真核细胞：主要用于外源基因的表达

6；转化：特指以质粒DNA活以它作为载体构建的重组子导入细菌的过程。

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2运载体与基因表达载体的区别

1、不同点：

⑴“运载体”泛指基因工程操作中能将目的基因送达受体细胞的工具。如细菌质粒等。

相对“基因表达载体”而言，“运载体”主要是强调它能运输目的基因这一功能，只要能运输目的基因就算是运载体，并不计较是不是真正运输了目的基因。

⑵“基因表达载体”，是实施了运输目的基因、并且要保证目的基因到达受体细胞后能够表达的运载体。

这样看来，运载体、基因表达载体二者之间就不能完全等同。

2、联系：

“基因表达载体”是在”运载体”的基础上构建成的。

基因表达载体的构成：目的基因+ 启动子+ 终止子+ 标记基因。

3、表达载体上的启动子和终止子是本身具有还是后加上去的呢？

这个问题，教科书中并没有明确说明，但我个人的观点是：这要看获取目的基因的方法，而问题的根源在于基因的结构。关于基因的结构，在新课程标准中也不再做为教学的要求了。

（人类）结构基因的基本结构：上游非编码区+ 启动子+ 编码区+ 终止子+ 下游非编码区

人类结构基因4个区域：

①前导区，位于编码区上游，相当于RNA5’末端非编码区（非翻译区）；

②编码区，包括外显子与内含子；

③尾部区，位于RNA3’编码区下游，相当于末端非编码区（非翻译区）；

④调控区，包括

目的基因与载体连接、 感受态制备及转化

【实验原理】

1；酶促生物化学反应过程

在一定的条件下，由DNA连接酶催化目的基因与载体相邻的5’端磷酸与3’端羟基之间形成磷酸二酯键的过程。相同或不同的限制性内切酶产生相同的粘性末端，在降至退火温度时，能重新互补结合，在DNA连接酶的催化下，目的基因与载体相连接。 2；DNA连接酶的分类：

T4 DNA连接酶：催化dsDNA粘末端连接及平端连接

大肠杆菌DNA连接酶：不能催化平末端连接,其底物只能是带缺口的双链DNA分子和具同源互补粘末端的不同DNA分子

3；T4 DNA连接酶：来源 T4噬菌体感染的大肠杆菌

最佳pH值 7.2～7.8，常用的反应液为pH7.6 的Tris-HCl缓冲液 需ATP，Mg2+参加反应

二硫苏糖醇等巯基化合物可促进连接酶的连接 作用；高浓度的Na+、K+等抑制酶的活性。

4；受体分类：受体细胞也称为宿主，是重组子扩增及表达的场所，分为原核细胞和真核细

胞两类。

5；应用：原核细胞：重组子复制扩增，外源基因表达系统 真核细胞：主要用于外源基因的表达

6；转化：特指以质粒DNA活以它作为载体构建的重组子导入细菌的过程。

反向收购

百科名片

反向收购（Reverse Merger ，又称买壳上市）是指非上市公司股东通过收购一家壳公司(上市公司)的股份控制该公司,再由该公司反向收购非上市公司的资产和业务,使之成为上市公司的子公司,原非上市公司的股东一般可以获得上市公司70%-90%的控股权。 目录 简介 收购流程 所需条件

? 相关概念反向收购上市与IPO上市的区别 ? 反向收购上市与直接上市（HPO）的比较

采取策略 交易步骤 历史演变

中国企业赴美反向收购的代价

简介

反收购属于公司收购合并的一种正常形式，在美国已经有长久的历史，是公司股票上市的捷径。目前，采用反收购的公司越来越多，每年以买壳而上市的公司与 IPO 方式上市的公司的数量基本持平（两者均为 350 件右）。 一个典型的买壳上市由两个交易步骤组成。一是买壳交易，非上市公司股东以收购上市公司股份的形式,绝对或相对地控制一家已经上市的股份公司；二是资产转让交易，上市公司收购非上市公司而控制非上市公司的资产及营运。

收购流程

下面的流程图，主要列示了反向收购的运作顺序和公司结构。其中，是否进行私募融资则要视情况而定。关于反向收购的具体步骤，请浏览流程详解。 1、挑选中介公司

反向

实验3.13 PN结正向压降与温度关系的研究和应用

常用的温度传感器有热电偶、测温电阻器和热敏电阻等，这些温度传感器均有各自的优点，但也有它的不足之处，如热电偶适用温度范围宽，但灵敏度低、且需要参考温度；热敏电阻灵敏度高、热响应快、体积小，缺点是非线性，且一致性较差，这对于仪表的校准和调节均感不便；测温电阻如铂电阻有精度高、线性好的优点，但灵敏度低且价格较贵；而PN结温度传感器则有灵敏度高、线性较好、热响应快和体积轻巧易集成化等优点，所以其应用势必日益广泛。但是这类温度传感器的工作温度一般为-50℃-150℃，与其它温度传感器相比，测温范围的局限性较大，有待于进一步改进和开发。 【实验目的】

1. 了解PN结正向压降随温度变化的基本关系式。

2. 在恒流小电流条件下，测绘PN结正向压降随温度变化曲线，并由此确定其灵敏度和被测PN结材料的禁带宽度。 3. 学习曲线改直的数据处理方法。 4. 学习用Excel进行曲线拟合的方法。 【实验仪器】

PN结正向压降温度特性实验仪、温度传感器实验装置、加热炉、Pt100温度传感器、PN结温度传感器、导线。 【实验原理】

理想PN结的正向电流IF和压降UF存在如下近似关系式：

IF?IS

PN结正向压降温度特性的研究

一、前言

早在六十年代初，人们就试图用PN结正向压降随温度升高而降低的特性作为测温元件，由于当时PN结的参数不稳定，始终未能进入实用阶段。随着半导体工艺水平的提高以及人们不断地探索，到七十年代时，PN结以及在此基础上发展起来的晶体管温度传感器，已成为一种新的测温技术跻身各个应用领域了。

众所周知，常用的温度传感器有热电偶、测温电阻器和热敏电阻等，这些温度传感器均有各自的优点，但也有它的不足之处，如热电偶适用范围宽，但灵敏度低、线性差且需要参考温度；热敏电阻灵敏度高、热响应快、体积小、缺点是非线性，这对于仪表的校准和控制系统的调节均感不便；测温电阻器如铂电阻虽有精度高、线性好的长处，但灵敏度低且价格昂贵；而PN结温度传感器则具有灵敏度高、线性好、热响应快和体积轻巧等特点，尤其是在温度数字化、温度控制以及用微机进行温度实时信号处理等方面，乃是其他温度传感器所不能相比的，其应用势必日益广泛。目前结型温度传感器主要以硅为材料，原因是硅材料易于实现功能化，即将测温单元和恒流、放大等电路组合成一块集成电路。美国Motorola电子器件公司在1979年就开始生产测温晶体管及其组件，如今灵敏度高达100mv/C、分辨率不低于0.

wowenwenpUC18 和 pUC19质粒图谱

pUC18 和 pUC19 大小只有 2686bp ，是最常用的质粒载体，其结构组成紧凑，几乎不含多余的 DNA 片段，GenBank注册号为 L08752（pUC18）和 X02514（pUC19）。由 pBR322 改造而来，其中 lacZ （MSC）来自 M13mp18/19 图 3-4 是其质粒图谱。

这两个质粒的结构几乎是完全一样的，只是多克隆位点的排列方向相反。这些质粒缺乏控制拷贝数的 rop 基因，因此其拷贝数达 500-700 。 pUC 系列载体含有一段 lacZ 蛋白氨基末端的部分编码序列，在特定的受体细胞中可表现 α-互补作用。因此在多克隆位点中插入了外源片段后，可通过 α-互补作用形成的蓝色和白色菌落筛选重组质粒。

特征序列区位：

pBR322_origin Ampicillin lac_promoter

1471 - 852 2486 - 1626 543 - 514

AmpR_promoter 2556 - 2528

M13_pUC_rev_primer 500 - 478 M13_reverse_primer 479 -