植物组织呼吸速率的测定

植物呼吸酶的测定

植物体内的呼吸酶，是催化植物在呼吸过程中，进行氧化还原的一些酶类。植物体内的末端氧化酶是将从基质传递来的电子，直接交给氧并产生H2O或H2O2。植物体内的末端氧化酶有抗坏血酸氧化酶、多酚氧化酶等。这个复杂的氧化酶系统，有助于植物对不良外界环境条件的适应。

通过本实验，掌握一个简便快速测定抗坏血酸氧化酶及多酚氧化酶活性的方法---滴定法测定抗坏血酸氧化酶和多酚氧化酶活性。 [实验原理]

1.抗坏血酸氧化酶活性的测定

抗坏血酸在抗坏血酸氧化酶的作用下，可以氧化为脱氢抗坏血酸。

抗坏血酸每抗坏血酸?1/2O2?????脱氢抗坏血酸

以抗坏血酸为底物，加入酶的提取液，酶与底物充分反应，此时抗坏血酸氧化酶将抗坏血酸消耗掉一部分，根据消耗的多少来计算酶的活性。抗坏血酸消耗的多，说明酶的活性强。

抗坏血酸的消耗量，可用碘液滴定剩余的抗坏血酸来测定。 I2的产生：KIO3+5KI+6HPO3→3I2+6KPO3+3H2O 用碘液滴定剩余的抗坏血酸：

抗坏血酸氧化酶抗坏血酸?I2???????脱氢抗坏血酸

2.多酚氧化酶活性的测定

多酚氧化酶在有氧存在的条件下，可以将酚氧化成醌，其反应如

下：

邻苯二酚?1/2O2?多酚氧化酶????邻醌

邻醌

植物组织MDA含量测定

一、目的要求

1．掌握植物组织MDA含量测定的原理及具体测量步骤；

2．深化理解MDA与逆境和衰老的关系，理解植物组织MDA含量测定的意义； 3．了解膜脂过氧化、氧自由基和MDA形成的关系；

4．能够根据待测材料的具体情况设计实验步骤测定MDA含量； 5．学习分光光度计，低温离心机等仪器的使用方法。

二、实验原理

植物遭受逆境胁迫或衰老时，体内会发生一系列生理生化变化，如核酸和蛋白质含量下降、叶绿素降解、光合作用降低，活性氧平衡失调及内源激素平衡失调等。活性氧代谢失调直接导致植物体内活性氧的大量积累，从而引发或加剧膜脂过氧化作用，造成细胞膜系统的损伤，严重时会导致植物细胞死亡。

膜脂过氧化的产物有二烯轭合物、脂类过氧化物、丙二醛、乙烷等。其中丙二醛（Malondialdehyde，MDA）是膜脂过氧化最重要的产物之一，它的产生还能加剧膜的损伤。因此在植物衰老生理和抗性生理研究中，MDA含量是一个常用指标，可通过测定MDA了解膜脂过氧化的程度，以间接测定膜系统受损程度以及植物的抗逆性。

MDA在高温及酸性环境下可与2-硫代巴比妥酸（TBA）反应，产生红棕色的产物3,5,5-三甲基恶唑2,4-二酮（Trimet—nine）

实验一 植物组织水势的测定（小液流法）

1、实验目的

了解植物组织中水分状况的一种表示方法及用于测定的方法及其优缺点。 2、实验原理

植物组织的水分状况可用水势来表示。植物体细胞之间、组织之间以及植物体与环境之间的水分移动方向都由水势差决定。将植物组织放在已知水势的一系列溶液中，如果植物组织的水势（Ψcell）小于某一溶液的水势（Ψout），则组织吸水，反之组织失水。若两者相等，水分交换保持动态平衡。组织的吸水或失水会使溶液的浓度、密度、电导率以及组织本身的体积与质量发生变化。根据这些参数的变化情况可确定与植物组织等水势的溶液。

液体交换法测定水势的方法有很多种，本实验练习用小液流法测定植物组织的水势，并初步观察其变化情况。

小液流法测定水势的原理

判据 △Ψ=Ψout-Ψcell

△Ψ>0 △Ψ<0 △Ψ=0 使用器材 适用的材料

3、仪器和试剂

试管，试管架，移液管，滴管，打孔机或单面刀片，镊子，解剖针，棉花，吸水纸； 0.05-0.4mol/L CaCl2溶液，甲烯蓝； 土豆 4、实验步骤

①将16支试管清洗干净，分为两组（实验组和对照组）按编号顺序倒置于试管架上，控净水分。

②配制一系列不同浓度的氯化钙溶液（0.05、0.1、0.15、0.2、0.25、0.3、0.35

植物组织中丙二醛的测定

一、实验目的和要求

1.了解植物叶片衰老过程中丙二醛（MDA）含量变化；

2.掌握测定丙二醛（MDA）含量的常用方法。

二、实验内容和原理

植物器官在逆境条件下或衰老时，自由基代谢失调，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛（MDA）是其产物之一，通常作为脂质过氧化指标，用于表示细胞膜脂过氧化程度和植物对逆境条件反应的强弱。

MDA在高温、酸性条件下与硫代巴比妥酸(TBA)反应，形成三甲基复合物，该复合物的最大吸收峰在532nm处，最小吸收峰在600nm处，消光系数为155 (mM)-1 cm-1。

三、实验材料和主要仪器

材料：新老叶蛋白提取液

仪器：移液枪，水浴箱，离心机，离心管，分光光度计

试剂：磷酸缓冲液，TBA，TCA

四、实验方法和步骤

1.制取提取液（一周前进行）

称叶龄差异明显的叶片各0.50g 左右，加入5ml 磷酸缓冲液（50mmol，pH值为7.8），于冰浴中研磨提取，匀浆液以8000g 离心力作用下（4℃）离心10min，其上清液即为提取液。

2.加试剂以及处理：

实验管：分别向1mL新老叶提取液中加TBA与TCA混合液4.0mL（92oC水浴保温30min）

空白管：1mL Pi-buffer +TBA与TCA混合液 4.0ml

实验一 植物组织水势的测定

姓名： 蔡璐 班级： n1101011 学号：n110101102

一、实验原理

根据渗透作用的原理，用小液滴法测得蔗糖溶液与植物组织中之间的等渗浓度，根据公式:

ΨW(细胞水势) =Ψs = -iCRT

求得溶液的水势，从而得知植物组织的水势。

二、实验材料

(1) 植物材料：女贞叶片

(2) 实验器具：细滴管；试管及指形管；烧杯；镊子、剪刀；移液管；标签纸 (3) 试 剂：1 mol/L蔗糖溶液；甲烯蓝溶液

三、实验步骤

1.用短滴管吸1M蔗糖溶液取0.5ml、 1ml、 2ml、 3ml 、4ml 分别放入10ml 刻度试管中，加蒸馏水至10ml，盖上塞子上下倒转混匀，配成0.05M、0.1M、0.2M、0.3M、0.4M的糖液。

步骤2 步骤3

2.用移液管从浓度各试管中吸出1ml注入对应的指形管内，各管均加塞，并贴上标签。

3.将女贞叶片在叠在一起，沿中脉两边用钻孔器打取10片小圆片，分别放入小指形管内，放置20min(期间摇动2~3次）后，加甲烯蓝2滴摇匀。 4.用长滴管吸取着色溶液放入原相应的蔗糖溶液中，慢慢放出一滴蓝色

实验1 植物组织渗透势的测定

一、质壁分离法

【实验目的】

掌握用质壁分离法测定植物组织渗透势的原理，学会观察质壁分离现象，并进行细胞渗透势的计算。 【实验原理】

将植物组织细胞浸泡在某种外界溶液中时，植物细胞内汁液与外液之间因渗透势存在差异会发生渗透作用。当细胞汁液的浓度大于外界溶液时，细胞失水，会发生质壁分离；当细胞汁液的浓度小于外界溶液时，细胞吸水；当细胞汁液与外液之间处于渗透平衡状态时，植物细胞内的压力势为零，细胞汁液的渗透势等于该溶液的渗透势。该外界溶液的浓度成为等渗浓度。

【实验仪器与材料、用品】

显微镜 载玻片 盖玻片 镊子 刀片 1mol/L的蔗糖母液（称取34.23g的蔗糖用蒸馏水配置成100ml的溶液） 移液器 带有色素的洋葱或紫鸭趾草 【主要内容】

设计并配制一系列浓度梯度的蔗糖溶液，通过实验找出使细胞发生初始质壁分离的浓度，计算植物组织的渗透势。 【实验步骤】

1、 按下表配制一系列浓度的蔗糖溶液，放入小烧杯中。

2、 取一层洋葱鳞片（或紫鸭趾草叶片、蚕豆、玉米等作物的叶片表皮），在外表皮上

用刀片切成约0.5-0.8×0.5-0.8的小方快，用小镊子从一角开始撕取表皮，迅速分别投入各种浓度的蔗糖

植物组织中丙二醛含量的测定

一、原理

植物器官衰老或在逆境下遭受伤害，往往发生膜脂过氧化作用，丙二醛(malondialdehydeMDA)是膜脂过氧化作用的产物之一，其含量可以反映植物遭受逆境伤害的程度。

丙二醛在酸性和高温条件，可以与硫代巴比妥酸(TBA)反应,形成在532nm波长处有最大光吸收的有色三甲基复合物，该复合物的吸光系数为155????????/(??·????)，并且在600nm处有最小光吸收。可按公式：

??532－??600=155000×??×??①

算出MDA浓度??(????????/??)，进一步算出单位质量组织中 MDA 含量(????????/??)。式中A532和A600分别表示532nm和600nm处的吸光度值。??为比色杯厚度(???? )。

需要指出的是，植物组织中糖类物质对MDA-TBA反应有干扰作用。为消除这种干扰，经试验，可用下列公式消除由蔗糖引起的误差。

??(????????/??)=6.45(??532－??600)?0.56??450 ②

式中： A450、A532和A600分别表示450nm、532nm 和600nm波长下的吸光度值。用公式②算出植物样品提取液中MDA的浓度后

实验 2 植物组织含水量的测定

一、原理

植物组织的含水量是反映植物组织水分生理状况的重要指标，药用植物含水量的多少对其品质有影响，种子含水状况对安全贮藏更有重要意义。利用水遇热蒸发为水蒸汽的原理，可用加热烘干法来测定植物组织中的含水量。植物组织含水量的表示方法，常以鲜重或干重的百分比表示，有时也以相对含水量百分比（或称饱和含水量百分比）表示。后者更能表明它的生理意义。 二、实验材料与仪器设备 （一）实验材料 植物鲜组织。 （二）仪器设备

分析天平，剪刀，烘箱，铝盒，干燥器，吸水纸，坩埚钳。 三、实验步骤 l. 自然含水量的测定

（ 1 ）铝盒的恒重 将洗净的两个铝盒编号，放在 105 ℃恒温烘箱中，烘 2 小时左右，用坩锅钳取出放入干燥器中冷却至室温后，在分析天平上称重，再于烘箱中烘 2 小时，同样于干燥器中冷却称重，

如此重复 2 次（ 2 次称重的误差不得超过 0.002g ），求得平均值 W 1 ，将铝盒放入干燥器中待用。

（ 2 ）将待测植物材料（如叶子等）从植株上取下后迅速剪成小块，装入已知重量的铝盒中盖好，在分析天平上准确称取重量，得铝盒与鲜样品总量为 W 2 ，然后于 105 ℃烘箱中干燥 4 ～

教案

课 题 教学目的 了解呼吸作用的概念及其生理意义；了解呼吸作用的生理指标及其影植物的呼吸作用 课 时 2 与 要 求 教学重点 与 难 点 响因素；掌握测定呼吸速率的基本方法；了解果实、块根、块茎等器官的呼吸特点和这些器官贮藏保鲜的关系；了解呼吸作用和光合作用的关系 （一）重点 1、有氧和无氧两大呼吸类型的特点、反应式、生理意义和异同点； 2、外界条件对呼吸速率的影响：温度、氧气、二氧化碳、水分； (二) 难点 种子的安全贮藏与呼吸作用、果实的呼吸作用 主 要 内 容 及 步 骤 教 学 过 程 第一节 呼吸作用 一、呼吸作用的概念及特点 二、光合作用与呼吸作用的关系 三、呼吸作用的生理意义 四、呼吸作用的指标与测定方法 备 注

光合作用与呼吸作用是植物代谢的两大核心内容。前者是物质合成与能量贮存过程，属于同化作用；后者是物质分解与能量释放过程，属于异化作用。生物的生长发育过程离不开能量，一切代谢过程都需要能量的推动。呼吸作用正是为生命活动提供能量的过程。没有呼吸就没有生命。

第一节 呼吸作用

一、呼吸作用的概念及特点

（一）呼吸作用的概念

呼吸作用是指生活细胞，在酶的参与下

实验方法

实验二 植物根系活力的测定

植物根系是活跃的吸收器官和合成器官，根的生长情况和活力水平直接影响地上部的营养状况及产量水平。本实验学习测定根系活力的甲烯蓝法。 【原理】

根据沙比宁等的理论，植物对溶质的吸收具有表面吸附的特性，并假定被吸附物质在根系表面形成一层均匀的单分子层；当根系对溶质的吸附达到饱和后，根系的活跃部分能将吸附着的物质进一步转移到细胞中去，并继续产生吸附作用。在测定根系活力时常用甲烯蓝作为吸附物质，其被吸附量可以根据吸附前后甲烯蓝浓度的改变算出，甲烯蓝浓度可用比色法测定。已知1mg甲烯蓝形成单分子层时覆盖的面积为1.1m2，据此可算出根系的总吸收面积。从吸附饱和后再吸附的甲烯蓝的量，可算出根系的活跃吸收表面积，作为根系吸收活力的指标。 【材料、仪器与试剂】 1.材料：植物根系。

2.仪器及用具：分光光度计；移液管；烧杯；比色管。

3.试剂：0.01 mg mL-1甲烯蓝溶液；0.0002 mol L-1（0.075 mg mL-1）甲烯蓝溶液。 【方法与步骤】

1. 甲烯蓝标准曲线的制作 按表2－1用0.01 mg mL-1甲烯蓝溶液配制系列标准溶液，于660 nm处测定吸光度，以甲烯蓝浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线