关于pcr的问题及答案

如何防止PCR形成引物二聚体？

在PCR后的电泳带形成很宽很亮的带，对照marker时都不容易看出其大小，具体是什么原因呢？PCR时模板DNA浓度一般是多少最合适？

答：1这条亮带如果在100bp一下就可以考虑是引物二聚体了，形成引物二聚体的原因很多，如引物设计的不好，在两端容易形成回文结构或是两条引物之间也可能会互补配对；退火温度没有达到最佳，实在不行就做个温度梯度吧；再就是试着改变一下循环数，也许会有帮助。

PCR模板大约在104-106个拷贝。

答2：我觉得是目的条带含量太多了，如果点样太多，负载量太大，就会造成跑胶时条带太宽。可以试着减少模板量，稀释10倍或是减少循环数。

答3：1. 从引物自身着手，重新设计引物，这是最根本解决这一问题的办法； 2. 可能模板有问题；PCR后的电泳带形成很宽很亮的带，可能是模板浓度过高或者循环次数过多所导致；

3. Taq酶，引物，Mg2+浓度可能过高，可降低它们的浓度；

4. 取你所要加的上下游引物混合后，在100摄氏度下的沸水中煮5分钟，然后迅速拿出至于冰块之上瞬时冷却，这时再加入反应体系当中，引物二聚体就会消失的； 5. 所配MIX中加5%的甘油或者5%

如何防止PCR形成引物二聚体？

在PCR后的电泳带形成很宽很亮的带，对照marker时都不容易看出其大小，具体是什么原因呢？PCR时模板DNA浓度一般是多少最合适？

答：1这条亮带如果在100bp一下就可以考虑是引物二聚体了，形成引物二聚体的原因很多，如引物设计的不好，在两端容易形成回文结构或是两条引物之间也可能会互补配对；退火温度没有达到最佳，实在不行就做个温度梯度吧；再就是试着改变一下循环数，也许会有帮助。

PCR模板大约在104-106个拷贝。

答2：我觉得是目的条带含量太多了，如果点样太多，负载量太大，就会造成跑胶时条带太宽。可以试着减少模板量，稀释10倍或是减少循环数。

答3：1. 从引物自身着手，重新设计引物，这是最根本解决这一问题的办法； 2. 可能模板有问题；PCR后的电泳带形成很宽很亮的带，可能是模板浓度过高或者循环次数过多所导致；

3. Taq酶，引物，Mg2+浓度可能过高，可降低它们的浓度；

4. 取你所要加的上下游引物混合后，在100摄氏度下的沸水中煮5分钟，然后迅速拿出至于冰块之上瞬时冷却，这时再加入反应体系当中，引物二聚体就会消失的； 5. 所配MIX中加5%的甘油或者5%的D

对实时定量PCR实验中遇到的常见问题总结。

实时定量PCR中的常见问题及解决办法

1、反应后无扩增曲线出现

1）确认程序中是否设置了信号采集步骤：两部法扩增程序一般将信号采集设置在退火延伸阶段；三步法扩增程序应当将信号采集设置在72℃延伸阶段。

2）扩增效率问题：电泳检测realtimePCR反应产物，观察是否有正确大小的目的条带出现。如果没有，则逐一排查引物、模板以及反应条件问题。

3）循环数不够：一般可设置循环数为40。

2、Ct值出现太晚

1）模板浓度过低或模板降解：重新制备模板再进行实验。

2）扩增效率低：优化反应条件，或者重新设计PCR引物。

3）PCR产物过长：一般设计为100-200bp即可。

4）反应体系中含有抑制剂：常在模板质量不高时出现，重新制备模板或将模板稀释后使用。

3、扩增曲线形状异常

1）扩增曲线不光滑：信号太弱，经系统矫正后产生。提高模板浓度重复实验。

2）扩增曲线断裂或下滑：模板浓度较高，基线的终点值大于Ct值。减小基线终点 (Ct值- 4)，重新分析数据。

3）个别扩增曲线突然骤降：反应管内留有气泡，由于温度升高后气泡破裂，使仪器检测到的荧光值突然降低所致。进行扩增反应之前要仔细检查反应管内是否有气泡残留。

4、阴性对照出现扩增曲线

1）阴

中国银行业垄断问题浅析

一． 背景

近日工农中建交五大国有商业银行相继公布年报，多家银行“日赚数亿”， 有关国内银行业的纷争再度燃起。国务院总理温家宝也坦率直言，“少数几家大银行处于垄断地位，银行获得利润太容易了”。国务院总理温家宝4月3日表示，国内银行业能够轻而易举地实现盈利，小部分银行在市场上占有垄断地位，融资渠道因此受限，所以必须打破银行业的垄断局面，以帮助民间资本进入金融市场，而中央已统一思想打破银行垄断。 二． 银行业垄断现状

从2010年的数据来看，16家上市银行中，五大商业银行营业收入占全部上市银行收入的78%以上，即在上市商业银行范围内，市场集中度CR5达到78%以上。从2009年以来的统计数据可以看出，五大国有银行总资产占全国银行业金融机构总资产的50%左右，若将政策性银行剔除，则比例更高。同时，也可以看出这一比例程缓慢下降趋势。在利润方面，2011年五大国有商业银行净利润水平占行业总利润的六成多。

这些均从市场结构上证明了我国银行业垄断问题的存在。 三． 银行业垄断产生的原因

考虑垄断产生的原因，人们首先会想到竞争数量不足。而根据银监会2010年年报统计的数据，当年年底如果加上外资法人银行和金融资产管理公司等其他银行业金融

中国银行业垄断问题浅析

一． 背景

近日工农中建交五大国有商业银行相继公布年报，多家银行“日赚数亿”， 有关国内银行业的纷争再度燃起。国务院总理温家宝也坦率直言，“少数几家大银行处于垄断地位，银行获得利润太容易了”。国务院总理温家宝4月3日表示，国内银行业能够轻而易举地实现盈利，小部分银行在市场上占有垄断地位，融资渠道因此受限，所以必须打破银行业的垄断局面，以帮助民间资本进入金融市场，而中央已统一思想打破银行垄断。 二． 银行业垄断现状

从2010年的数据来看，16家上市银行中，五大商业银行营业收入占全部上市银行收入的78%以上，即在上市商业银行范围内，市场集中度CR5达到78%以上。从2009年以来的统计数据可以看出，五大国有银行总资产占全国银行业金融机构总资产的50%左右，若将政策性银行剔除，则比例更高。同时，也可以看出这一比例程缓慢下降趋势。在利润方面，2011年五大国有商业银行净利润水平占行业总利润的六成多。

这些均从市场结构上证明了我国银行业垄断问题的存在。 三． 银行业垄断产生的原因

考虑垄断产生的原因，人们首先会想到竞争数量不足。而根据银监会2010年年报统计的数据，当年年底如果加上外资法人银行和金融资产管理公司等其他银行业金融

中国银行业垄断问题浅析

一． 背景

近日工农中建交五大国有商业银行相继公布年报，多家银行“日赚数亿”， 有关国内银行业的纷争再度燃起。国务院总理温家宝也坦率直言，“少数几家大银行处于垄断地位，银行获得利润太容易了”。国务院总理温家宝4月3日表示，国内银行业能够轻而易举地实现盈利，小部分银行在市场上占有垄断地位，融资渠道因此受限，所以必须打破银行业的垄断局面，以帮助民间资本进入金融市场，而中央已统一思想打破银行垄断。 二． 银行业垄断现状

从2010年的数据来看，16家上市银行中，五大商业银行营业收入占全部上市银行收入的78%以上，即在上市商业银行范围内，市场集中度CR5达到78%以上。从2009年以来的统计数据可以看出，五大国有银行总资产占全国银行业金融机构总资产的50%左右，若将政策性银行剔除，则比例更高。同时，也可以看出这一比例程缓慢下降趋势。在利润方面，2011年五大国有商业银行净利润水平占行业总利润的六成多。

这些均从市场结构上证明了我国银行业垄断问题的存在。 三． 银行业垄断产生的原因

考虑垄断产生的原因，人们首先会想到竞争数量不足。而根据银监会2010年年报统计的数据，当年年底如果加上外资法人银行和金融资产管理公司等其他银行业金融

荧光定量PCR实验结果数据分析中遇到的可能问题汇总

荧光定量PCR问题疑难解答（一）

Q：1. 这两天我做标准曲线，线性关系还行，R平方0.998。但是扩增效率只有80%，另外扩增曲线也不是太光滑。2.我用SYBR作为荧光染料，样品的荧光强度也挺低的，只有100-200左右。

A：曲线不光滑有时跟染料的量相关，可以加大看看，或者就是扩增产物太少了。

1. PCR反应效率差：引物，试剂PCR条件的原因。

做realtime-pcr优化体系很重要，你的扩增效率低。可以增加Mg离子的浓度，如果其他条件都好了，还不行，那就是引物的原因，那你就只能重新设计引物了。 2. PCR中混入影响反应的物质：

模板提取方法需要改进

3. 样品稀释不准确：

正常情况10倍比稀释时，前后是相差3.32个循环。 这很重要，做标准曲线很多不好的时候，很多都是倍比稀释的问题，

Q：荧光定量PCR的灵敏度

A：对于染料法的荧光定量来说，Ct值在13~30之间比较准确，30~33之间需要再次确认，在以上范围内的置信度比较差。

Q：标准曲线要重复两三次吗?

A：没有人说做定量PCR标准曲线要重复两三次，只是用来做标准曲线的梯度点最好不要少于4个，否则标准曲线准确性不高。

生物学实验技术

植物总RNA的提取及RT-PCR

一、实验目的

1. 学习从植物组织中提取总RNA的方法

2. 了解RT-PCR的基本原理和实验方法

二、实验原理

1. RNA提取的原理

RNA是一类极易降解的分子，要得到完整的RNA，必须最大限度地抑制提取过程中内源性及外源性核糖核酸酶对RNA的降解。高浓度强变性剂异硫氰酸胍可溶解蛋白质，破坏细胞结构，使核蛋白与核酸分离，失活RNA酶，所以RNA从细胞中释放出来时不被降解。细胞裂解后，除了RNA，还有DNA、蛋白质和细胞碎片，通过酚、氯仿等有机溶剂处理得到纯化、均一的总RNA。

2. RT-PCR的原理

提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）作引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于分析基因的转录产物、获取目的基因和合成cDNA探针等。

三、仪器、药品与试剂配方

(一) 仪器及器皿

1． 低温离心机； 2．琼脂糖凝胶电泳系统； 3． 高压灭菌锅；

4. PCR仪； 5． 研钵； 6. 一次

生物学实验技术

植物总RNA的提取及RT-PCR

一、实验目的

1. 学习从植物组织中提取总RNA的方法

2. 了解RT-PCR的基本原理和实验方法

二、实验原理

1. RNA提取的原理

RNA是一类极易降解的分子，要得到完整的RNA，必须最大限度地抑制提取过程中内源性及外源性核糖核酸酶对RNA的降解。高浓度强变性剂异硫氰酸胍可溶解蛋白质，破坏细胞结构，使核蛋白与核酸分离，失活RNA酶，所以RNA从细胞中释放出来时不被降解。细胞裂解后，除了RNA，还有DNA、蛋白质和细胞碎片，通过酚、氯仿等有机溶剂处理得到纯化、均一的总RNA。

2. RT-PCR的原理

提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）作引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于分析基因的转录产物、获取目的基因和合成cDNA探针等。

三、仪器、药品与试剂配方

(一) 仪器及器皿

1． 低温离心机； 2．琼脂糖凝胶电泳系统； 3． 高压灭菌锅；

4. PCR仪； 5． 研钵； 6. 一次

PCR技术应用及注意事项威斯腾生物技术中心 TEL:400 675 6758 2014.9.1

背景

PCR:聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)是一种用于放大扩增特定的 DNA片段的分子生物学技术。

1971 Khorana 等最早提出核酸体外扩增的设想； 1983年Mullis发明并申请专利。

原理

根据DNA的半保留复制。相关酶

双链DNA

单链

DNA聚合酶 碱基互补配对

复制

两分子拷贝。

在体外实验中，DNA在高温时也可以发生变性解链，当温度降低后又可以复 性成为双链。因此，通过温度变化控制DNA的变性和复性，加入设计引物， DNA聚合酶、dNTP就可以完成特定基因的体外复制。

反应体系

缓冲液 4种dNTP混合物(终浓度) 引物(终浓度) 模板DNA Taq DNA聚合酶(耐热DNA聚合酶--Taq酶的发现对于PCR的应用有里程碑的意义，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活，不需要每个 循环加酶，使PCR技术变得非常简捷、同时也大大降低了成本。)

Mg2+(终浓度) 双蒸水

步骤

变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成。 ①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR