基因工程引物设计流程

口腔鳞癌组织中肿瘤转移相关基因1（MTA1）

一、选择原因及应用

口腔鳞癌组织中肿瘤转移相关基因1（MTA1）在蛋白和mRNA的表达水平，揭示其与口腔鳞癌（OSCC）发生、发展的关系。方法采用免疫组织化学法和原位杂交技术检测46例OSCC标本、15例口腔黏膜白斑与20例正常口腔黏膜标本中MTAl基因的表达水平，并分析其与OSCC临床病理学参数的关系。结果MTA1蛋白和MTA1mRNA在OSCC组织中的表达水平显著高于口腔黏膜白斑和正常口腔黏膜（P〈0．05），口腔黏膜白斑中MTA1蛋白和MTA1mRNA表达水平显著高于口腔正常黏膜（P〈0．01），MTA1蛋白和MTA1mRNA表达与肿瘤浸润深度和淋巴结转移密切相关（P〈0．05）。结论MTA1基因在蛋白和mRNA的表达水平在OSCC发生、发展及浸润转移过程中起一定促进作用，有望成为判断OSCC预后及选择治疗方案的一个新肿瘤标志物。

二、2查阅NCBI得到MTA1相关信息并获得目的基因

PREDICTED: Gorilla gorilla gorilla metastasis associated 1 (MTA1), mRNA

NCBI Reference Sequence: XM_00405

PCR引物设计流程

（以扩增鹅PHIP基因编码区序列为例）

一． 流程图

二． 确定模板 1. 确定模板来源物种

近亲物种 ：原鸡，绿头野鸭，鸽，雀，鹦鹉，蜂鸟等

常用物种 ：灵长类（人，大猩猩，恒河猴），哺乳类（大鼠，小家鼠，猪，牛，羊，狗），爬行类（鳄，龟），两栖类（蛙，蟾蜍），鱼类（斑马鱼，亚马逊帆鱼）

一般在每一类常用物种中选择一个物种，在近亲物种中选择2种以上作为模板。如，扩增鹅PHIP基因选择以下物种序列为引物设计模板：鸡，鸭，人，小鼠，蟾蜍，斑马鱼。 2. 利用NCBI得到各物种需扩增基因的模板序列

A. 进入NCBI主页 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ，选定搜索范围为“Gene”，关键词为“PHIP”，得到如下图搜索结果（也可在关键词中包含物种名，如“PHIP Anser”，物种的英文名和拉丁学名在搜索时都可使用）。

B. 点击所需物种的PHIP基因，进入该基因的报告页面（以人PHIP基因为例）。基因报告页面中部Refseq条目中显示该基因在NCBI中的参考序列，该条目下可得到mRNA序列。如下图。另，关于RefSeq条目的相关名词解释参考 http://www.ncbi.nlm.nih.gov

PCR引物设计流程

（以扩增鹅PHIP基因编码区序列为例）

一． 流程图

二． 确定模板 1. 确定模板来源物种

近亲物种 ：原鸡，绿头野鸭，鸽，雀，鹦鹉，蜂鸟等

常用物种 ：灵长类（人，大猩猩，恒河猴），哺乳类（大鼠，小家鼠，猪，牛，羊，狗），爬行类（鳄，龟），两栖类（蛙，蟾蜍），鱼类（斑马鱼，亚马逊帆鱼）

一般在每一类常用物种中选择一个物种，在近亲物种中选择2种以上作为模板。如，扩增鹅PHIP基因选择以下物种序列为引物设计模板：鸡，鸭，人，小鼠，蟾蜍，斑马鱼。 2. 利用NCBI得到各物种需扩增基因的模板序列

A. 进入NCBI主页 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/ ，选定搜索范围为“Gene”，关键词为“PHIP”，得到如下图搜索结果（也可在关键词中包含物种名，如“PHIP Anser”，物种的英文名和拉丁学名在搜索时都可使用）。

B. 点击所需物种的PHIP基因，进入该基因的报告页面（以人PHIP基因为例）。基因报告页面中部Refseq条目中显示该基因在NCBI中的参考序列，该条目下可得到mRNA序列。如下图。另，关于RefSeq条目的相关名词解释参考 http://www.ncbi.nlm.nih.gov

基因工程载体

---乳酸菌表达载体pMG36e及其应用现状

目前，多数外源基因的克隆与表达，主要采用大肠杆菌。然而，由于大肠杆

菌能够引起人类和动物发生不同程度的腹泻，导致机体损伤，所以其表达产物需要经过复杂的分离纯化才能达到食品医药标准。与之相比，乳酸菌作为人和动物肠道内正常菌群之一，已被证明具有诸多益生功能，而且被公认为安全无毒的 (Generally regarded as safe，GRAS)。因此，采用乳酸菌表达的外源蛋白质可免去上述复杂、繁琐的后提纯工艺；同时，乳酸菌可以在肠道中存活定植，其外源基因表达用于治疗或免疫作用的活性物质可以持续地在肠道中产生，成为人和动物体内功能性生物制剂的“加工车间”，从而起到相应的保护和治疗性作用。

乳酸菌（Lacticacidbacteria，LAB）是一类能够发酵糖类产生乳酸的革兰氏阳性细菌［1］，具有诸如缓解乳糖不耐症、调节消化道微生态平衡等益生作用，应用领域十分广泛。随着近二十几年来分子生物学的发展，以乳酸菌作为宿主，利用质粒表达外源基因，对乳酸菌进行改造以进一步提高其功能已成为目前的研究热点之一。乳酸菌常用质粒载体主要有pWV01衍生载体，pNZ系列载体［2］等。质粒pMG36e来源

基因工程试题库

001 基因工程操作的三大基本元件是【 】 I 供体 II 受体 III 载体 IV 抗体 V 配体 Ａ I + II + III Ｂ I + III + IV Ｃ II + III + IV Ｄ II + IV + V Ｅ III + IV + V

002 根据当今生命科学理论，基因工程的用途是【 】

I 分离纯化基因 II 大量生产生物分子 III 构建新型物种 IV 提高基因重组效率 Ａ I + II + III Ｂ I + II + IV Ｃ I + III + IV Ｄ II + III + IV

Ｅ I + II + III + IV

003 基因工程的三大理论基石是【 】 Ａ 经典遗传学、细胞生物学、微生物学 Ｂ 分子遗传学、分子生物学、生化工程学 Ｃ 动物学、植物学、微生物学

Ｄ 生物化学、生化工程学、化学工程学 Ｅ 生理学、仿生学、免疫学

004 根据基因工程的定义，下列各名词中不能替代基因工程的是【 】 Ａ 基因诱变 Ｂ 分子克隆 Ｃ DNA重组 Ｄ 遗传工程

Ｅ 基因无性繁殖

005 基因工程的单元操作顺序是【 】 Ａ 增，转，检，切，接 Ｂ 切，接，转，增，检 Ｃ 接，转，增，检，切 Ｄ 检，

幻灯片1

基因工程

（GENETIC ENGINEERING）

幻灯片2

第一节 概 述

幻灯片3

基因工程技术的定义

用人工方法，提取或制备某种细胞的某种基因，在体外把它和一种载体连接构造杂种DNA分子，然后导入受体细胞，让其复制与表达，以改变受体细胞的某些性状或产生人们所需的产物的实验工程技术。

幻灯片4

DNA重组(DNA recombination)

DNA重组（DNA recombination）：不同来源的DNA分子末端通过磷酸二酯键共价连接，形成重新组合的DNA分子。 幻灯片5

克隆（clone）

克隆（clone）:由一个细胞经无性繁殖而形成的细胞群体。 幻灯片6

分子克隆(molecular cloning)

分子克隆（molecular cloning）:指建立单一的重组DNA的无性系的过程。即指在体外制备DNA，切割拼接成重组D

1.动物细胞DNA提取原理是什么?

答：先用SDS裂解细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸。然后用等体积酚/氯仿/异戊醇抽提，使蛋白质变性沉降到酚与水相的界面，DNA则留在水相中，离心后在上清液中加入醋酸钠和两倍体积无水乙醇，除去多糖物质和沉淀DNA，然后离心后沉淀用70%乙醇洗涤，最后用ddH2O溶解沉淀DNA，－20℃保存。 2.DNA提取中用到了哪些试剂？有什么作用？

EDTA:二价金属离子螯合剂，螯合Mg2+，抑制DNA酶活性。因为Mg离子是DNA酶的辅因子。

SDS:一种阴离子去污剂，在高温（55℃—65℃）条件下能裂解细胞，使染色体离析，蛋白质变性，释放出核酸。 酚:使蛋白质变性。

氯仿:作为除杂剂，除去糖、脂等杂质；加速有机相与液相分离；抽提核酸溶液中残留的酚。 乙丙醇:作为消泡剂；降低DNA的水溶性，让DNA从溶液中析出；有利于分层，使离心后的上层含DNA水相，中间的蛋白质相及下层有机溶液相维持稳定。 无水乙醇:降低DNA的水溶性，沉淀DNA。

醋酸纳:调PH，中和Tris-Buffer，形成中性环境，利于DNA沉淀。 Tris-Buffer（PH8.0）:提供一个缓冲环境，防止核酸被破坏。 70％乙醇:清洗溶液中离子及

基 因 工 程 讲 义

主讲教师──陈永胜

1

目 录

第一章 绪 论???????????????????3

一、基因工程的诞生???????????????????3 二、基因工程的成就???????????????????5 三、基因工程安全性的问题???????????????? 6 四、基因工程研究的内容????????????????? 8

第二章 基因克隆所需的工具酶??????????? 12

一、限制性内切酶(restriction enzyme)????????????

12

二、DNA连接酶???????????????????? 20 三、DNA聚合酶???????????????????? 24 四、逆转录酶????????????????????? 27

第三章 基因的克隆载体 ?????????????? 28

一、质粒载体????????????????????? 28 二、大肠杆菌质粒载体 ????????????????? 30 三、λ噬菌体载体????????????????????33 四、粘粒载体（柯斯质粒载体）??????????????

基因工程试卷B

一． 名词解释（每个2分，共20分）

1、转化:

2、质粒转移性:

3、DNA文库:

4、RACE:

5、选择标记基因:

6、降落PCR

7、载体:

8、感受态细胞:

9CaMV35s:

10、ORF:

二、选择题（每题1分，共15分）

1( ) 限制性核酸内切酶是由细菌产生的，其生理意义是

A 修复自身的遗传缺陷 B 促进自身的基因重组 C 强化自身的核酸代谢 D 提高自身的防御能力 2( )生物工程的下游技术是

A 基因工程及分离工程 B 蛋白质工程及发酵工程 C 基因工程及蛋白质工程 D分离工程 及蛋白质工程

3 ( )基因工程操作常用的酶是:(I 内切酶II 连接酶III 末端转移酶IV聚合酶

A. I + II B. I + III + IV C. II + III + IV D. I +II + IV + III 4 ( )限制性内切核酸酶的星活性是指：

A 在非常规条件下，识别和切割序列也不发生变化的活性。 B 活性大大提高 C 切割速度大大加快 D识别序列与原

1、DNA载体经HindⅢ切割后产生粘性末端，能发生载体自连，影响载体与外源DNA的连接效率，常用的防止载体自连的方法有碱性磷酸酶处理使5’磷酸基团羟基化。 2、切口平移是指在DNA聚合酶Ⅰ的作用下，使5’磷酸基团带上放射性标记。

在酶切缓冲液中，一般需加入BSA，请问加入BSA的作用是提高蛋白质浓度防止酶失活。 3、下列哪一种酶作用时需要引物（B）反转录酶在作用时需要DNA聚合酶，而后者需要引物 A、末端转移酶B、反转录酶C、 DNA 连接酶D、限制酶 4、下列DNA片段，最可能含有SstI 酶切位点的是（A） Ａ GGAGAGCCTCT Ｂ GAGCACATCT Ｃ CCCTGTGGGA Ｄ ATCCTACATG Ｅ AACCTTGGAA DNA连接酶的作用特点有哪些？

1、DNA 3’端有游离的-OH，5’端有一个磷酸基团（P） 2、需要能量、Mg2+

3、被连接的DNA链必须是双螺旋的一部分 4、只封闭双螺旋DNA骨架上的nick

大肠杆菌DNA聚合酶I有哪些不同的酶活力特性，各有何利用价值。 1、5’— 3’聚合酶活性：以DNA为模板利用四种dNTP合成DNA链 2、3’— 5’外切酶活性：主要起校对作用

3、5’