重组蛋白纯化与分离实验

大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化

一 可溶性蛋白的纯化 （一）菌体的破碎

1. 仪器与材料：-80℃冰箱；超声波细胞破碎仪；50mM PBS或50mM Tris-HCl pH

7.5；50ml 离心管；冷冻高速离心机 2. 方法 2.1反复冻融

2.1.1收集菌液500ml，等分10份，4000 r/min 4℃离心15min，弃上清。 2.1.2 菌体沉淀中加入相同菌液体积的50mM PBS 或50mM Tris-HCl（选择使蛋白稳定的缓冲液和pH）重悬洗涤一次。

2.1.3 然后按原菌液体积的1/4加入缓冲液重悬菌体，并加入蛋白酶抑制剂PMSF和EDTA(带His标签不加)，PMSF终浓度为100μg/ml, EDTA的终浓度为0.2mM（约为58μg/ml） 。取20μl重悬菌液进行电泳，检测蛋白表达的情况（是否表达，是可溶性表达还是包涵体表达）。

2.1.4 将菌液（经检测有表达）在-80度冰冻，室温融解，反复冻融三次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。

2.2 超声波处理 (对超声波及热敏感的蛋白慎用)

2.2.1 将反复冻融的菌液（必要时可加入1mg/ml 溶菌酶，缓冲液pH＞8

大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化

一 可溶性蛋白的纯化 （一）菌体的破碎

1. 仪器与材料：-80℃冰箱；超声波细胞破碎仪；50mM PBS或50mM Tris-HCl pH

7.5；50ml 离心管；冷冻高速离心机 2. 方法 2.1反复冻融

2.1.1收集菌液500ml，等分10份，4000 r/min 4℃离心15min，弃上清。 2.1.2 菌体沉淀中加入相同菌液体积的50mM PBS 或50mM Tris-HCl（选择使蛋白稳定的缓冲液和pH）重悬洗涤一次。

2.1.3 然后按原菌液体积的1/4加入缓冲液重悬菌体，并加入蛋白酶抑制剂PMSF和EDTA(带His标签不加)，PMSF终浓度为100μg/ml, EDTA的终浓度为0.2mM（约为58μg/ml） 。取20μl重悬菌液进行电泳，检测蛋白表达的情况（是否表达，是可溶性表达还是包涵体表达）。

2.1.4 将菌液（经检测有表达）在-80度冰冻，室温融解，反复冻融三次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。

2.2 超声波处理 (对超声波及热敏感的蛋白慎用)

2.2.1 将反复冻融的菌液（必要时可加入1mg/ml 溶菌酶，缓冲液pH＞8

重组蛋白纯化基本策略

捕获阶段：目标是澄清、浓缩和稳定目标蛋白。 中度纯化阶段：目标是除去大多数大量杂质，如其它蛋白、核酸、内毒素和病毒等。 精制阶段：除去残余的痕量杂质和必须去除的杂质。 分离方法的选择 根据蛋白质的特殊性质采用不同的分离方法：蛋白质的性质方法电荷（等电点）离子交换（IEX）分子量凝胶过滤（GF）疏水性疏水（HIC）反相（RPC）特异性结合亲和（AC）每一种方法都有分辨率、处理量、速度和回收率之间的平衡。 分辨率：由选择的方法和层析介质生成窄峰的能力来实现。总的来说，当杂质和目标蛋白性质相似时，在纯化的最后阶段分辨率是重要因素。 处理量：一般指在纯化过程中目标蛋白的上样量。如上样体积、浓度等。 速度：在初纯化中是重要因素，此时杂质如蛋白酶必须尽快除去。 回收率：随着纯化的进行渐趋重要，因为纯化产物的价值在增加。 在三阶段纯化策略中每一种方法的适用性见下表：技术主要特点捕获中度纯化精制样品起始状态样品最终状态IEX高分辨率高容量高速度低离子强度样品体积不限高离子强度或pH改变。样品浓缩HIC分辨率好容量好高速度高离子强度样品体积不限低离子强度样品浓缩AC高分辨率高容量高速度结合条件特殊样品体积不限洗脱条件特殊样品浓缩G

大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化

一 可溶性蛋白的纯化

（一）菌体的破碎 1. 仪器与材料：-80℃冰箱；超声波细胞破碎仪；50mM PBS或50mM Tris-HCl pH 7.5；50ml 离心管；冷冻高速离心机

2. 方法

2.1反复冻融

2.1.1收集菌液500ml，等分10份，4000 r/min 4℃离心15min，弃上清。

2.1.2 菌体沉淀中加入相同菌液体积的50mM PBS 或50mM Tris-HCl（选择使蛋白稳定的缓冲液和pH）重悬洗涤一次。

2.1.3 然后按原菌液体积的1/4加入缓冲液重悬菌体，并加入蛋白酶抑制剂PMSF和EDTA(带His标签不加)，PMSF终浓度为100μg/ml, EDTA的终浓度为 。取20μl重悬菌液进行电泳，检测蛋白表达的情况（是否表达，是可溶性表达还是包涵体表达）。

2.1.4 将菌液（经检测有表达）在-80度冰冻，室温融解，反复几次（反复冻融三次），由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。

2.2 超声波处理 (对超声波及热敏感的蛋白慎用)

2.2.1 将反复冻融的菌液（必要时可加入1mg/ml 溶菌酶，缓冲液pH＞8.0，加入后需静置20m

实验一 蛋白质含量分析（Bradford检测法）

一、 实验目的

1、 制作蛋白质浓度标准曲线；

2、 测定未知蛋白质浓度样品的吸光度，根据标准曲线计算出蛋白质的浓度。

二、 实验原理

Bradford法（考马斯亮蓝法）测定蛋白质浓度是1976年由Bradford建立的，是最常用的蛋白质快速定量方法。该方法根据蛋白质与染料相结合的原理设计，考马斯亮蓝G-250（CBB G-250）在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm；当它在酸性溶液中与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-染料结合物在595nm波长下有最大光吸收，且光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质含量的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝结合在2min左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速，其结合物在室温下1h内保持稳定。

Bradford法的突出优点是：灵敏度高；测定快速、简便，只需加一种试剂；干扰物质少。此法的缺点是：仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物有去污剂、Triton X-100、SDS和0.1N的NaOH。

三、 试剂与器材 1、试剂：

1mg/ml 牛血清蛋白（BSA）母液；考马斯亮蓝G-250；无水乙醇；85%磷酸；Mil

中国重组蛋白药物市场报告

1、重组蛋白药物概念（不包含单克隆抗体、疫苗） 重组蛋白质是指利用 DNA 重组技术生产的蛋白质。绝大部分重组蛋白药物是人体蛋白或其突变体。主要包含细胞因子类药物、单克隆抗体、基因工程疫苗等。 重组药物的表达系统分为原核生物和真核生物表达系统。原核生物主要是大肠杆菌表达系统，真核生物表达系统主要有酵母菌、哺乳动物细胞表达系统。

目前中国上市的的重组蛋白类药物主要是大肠杆菌生产的细胞因子类药物。

美国在研药物中70%是由以中国仓鼠卵巢细胞(CHO)为主的哺乳动物细胞表达的。 2、中国第一个重组蛋白药物的时间、品种

1993年，我国研制成功第一个重组蛋白药物———干扰素α-1b。 3、中国重组蛋白药物的品种，主要厂家 品种

市场情况

国内主要厂家

重组人生长激素

国内5.4亿人民币

5家，深圳科兴；长春金赛，上海联合赛尔，诺和诺德；安徽安科等

G-CSF

18家，华北制药、长春金赛、北京双鹭、山东齐鲁制药、苏州中凯药业、广西北海方舟药业、上海三维生物技术有限公司等

干扰素INFα

20家，北京三元基因、深圳科兴、上海罗氏、天津华立达的安福隆、上海先灵葆雅等

胰岛素及类似物

中国23亿人民

中国重组蛋白药物市场报告

1、重组蛋白药物概念（不包含单克隆抗体、疫苗） 重组蛋白质是指利用 DNA 重组技术生产的蛋白质。绝大部分重组蛋白药物是人体蛋白或其突变体。主要包含细胞因子类药物、单克隆抗体、基因工程疫苗等。 重组药物的表达系统分为原核生物和真核生物表达系统。原核生物主要是大肠杆菌表达系统，真核生物表达系统主要有酵母菌、哺乳动物细胞表达系统。

目前中国上市的的重组蛋白类药物主要是大肠杆菌生产的细胞因子类药物。

美国在研药物中70%是由以中国仓鼠卵巢细胞(CHO)为主的哺乳动物细胞表达的。 2、中国第一个重组蛋白药物的时间、品种

1993年，我国研制成功第一个重组蛋白药物———干扰素α-1b。 3、中国重组蛋白药物的品种，主要厂家 品种

市场情况

国内主要厂家

重组人生长激素

国内5.4亿人民币

5家，深圳科兴；长春金赛，上海联合赛尔，诺和诺德；安徽安科等

G-CSF

18家，华北制药、长春金赛、北京双鹭、山东齐鲁制药、苏州中凯药业、广西北海方舟药业、上海三维生物技术有限公司等

干扰素INFα

20家，北京三元基因、深圳科兴、上海罗氏、天津华立达的安福隆、上海先灵葆雅等

胰岛素及类似物

中国23亿人民

蛋白质分离纯化的一般程序可分为以下几个步骤：

（一）材料的预处理及细胞破碎

分离提纯某一种蛋白质时，首先要把蛋白质从组织或细胞中释放出来并保持原来的天然状态，不丧失活性。所以要采用适当的方法将组织和细胞破碎。常用的破碎组织细胞的方法有： 1. 机械破碎法

这种方法是利用机械力的剪切作用，使细胞破碎。常用设备有，高速组织捣碎机、匀浆器、研钵等。 2. 渗透破碎法

这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。 3. 反复冻融法

生物组织经冻结后，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破。这种方法简单方便，但要注意那些对温度变化敏感的蛋白质不宜采用此法。 4. 超声波法

使用超声波震荡器使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。 5. 酶法

如用溶菌酶破坏微生物细胞等。 (二) 蛋白质的抽提

通常选择适当的缓冲液溶剂把蛋白质提取出来。抽提所用缓冲液的pH、离子强度、组成成分等条件的选择应根据欲制备的蛋白质的性质而定。如膜蛋白的抽提，抽提缓冲液中一般要加入表面活性剂（十二烷基磺酸钠、tritonX-100等），使膜结构破坏，利于蛋白质与膜分离。在抽提过程中，应注意温度，避免剧烈搅拌等，以防止蛋白质的变性。 （三）蛋白质粗制品的获得

选用适当的方法将所要的蛋白质

Ⅲ—01血清γ球蛋白的分离与纯化

精品资料

Ⅲ—01 血清γ球蛋白的分离与纯化【目的要求】

1.掌握分离纯化蛋白质的基本原理和基本过程。

2.熟悉盐析、离心、层析、电泳、比色等生物化学基本技术在蛋白质分离纯化中的综合应用。

4.学会设计和制定分离纯化蛋白质的实验方案、技术路线和质量监控和保证措施。

【实验原理】

不同蛋白质的理化性质和生物学性质各有不同，利用这些不同便可获得分离纯化。

血清蛋白有300多种,可粗略分成清、球蛋白两大类，γ球蛋白只是球蛋白中的一个亚类。欲用常规方法获得，可先用半饱和硫酸铵从血清中盐析出球蛋白，接着用葡聚糖凝胶G—25（Sephadex—25）脱去球蛋白中的盐分（硫酸铵），最后用DEAE（二乙基氨基乙基）纤维素阴离子交换柱，便可直接从脱盐的球蛋白溶液中分离纯化出γ球蛋白，其反应机理如下：

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精品资料

被柱层析交换结合的α球蛋白和β球蛋白，可通过增加洗脱液的离子强度或降低洗脱的pH值（也可两者同时改变），使其分部洗脱下来而被纯化。

纯化前后的γ球蛋白可用电泳方法进行比较鉴定。

【实验准备】

一、器材

1.离心机

2.层析柱(直径约1-1.2cm,长约30cm)

3.电泳仪

二、试剂

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凝胶层析法分离纯化蛋白质实验

凝胶层析法分离纯化蛋白质

凝胶层析法分离纯化蛋白质实验

【目的】掌握凝胶层析的基本原理 学习利用凝胶层析法分离纯化蛋白质的实验 技能

凝胶层析法分离纯化蛋白质实验

【原理】 凝胶层析也称分子筛层析、排阻层析。 是利用具有网状结构的凝胶的分子筛作用， 根据被分离物质的分子大小不同来进行分 离的技术。

凝胶层析法分离纯化蛋白质实验

凝胶过滤层析凝胶层析是按照蛋

白质分子量大小进行分离的技术，又称之凝胶 过滤、分子筛层析或排 阻层析。

单个凝胶珠本身象“筛子”。不同类型凝 胶的筛孔的大小不同。

凝胶层析法分离纯化蛋白质实验

带网孔的 葡聚糖珠小分子进入 葡聚糖珠内

大分子不 能进入珠 内，经珠 之间缝隙 流出

凝胶过滤层析过程示意图

凝胶层析法分离纯化蛋白质实验

凝胶 珠

凝胶基质

小分子 大分子

凝胶过滤层析过程示意图

凝胶层析法分离纯化蛋白质实验

总结：相对分子质量较大的物质由于直径大于凝胶网孔被完全排 阻在孔外，只能在凝胶颗粒外的空间向下流动，因此流程 较短，移动速度快；所以首先流出。 相对分子质量较小的物质由于直径小于凝胶网孔，可完全 渗透进入凝胶颗粒的网孔，在向下移动过程中，因此流程 较长，移动速率慢；所以最后流出。 中等大小的分子，它们在凝胶颗粒