如何在大肠杆菌中高效表达目的基因

在大肠杆菌中高效表达外源蛋白的策略

本世纪60至70年代对大肠杆菌的研究使之成为自然界中最普遍为人们所认识的生物体。大肠杆菌具有两个显著特征：操作简单和能在廉价的培养基中高密度培养，它的这些特征加上十多年外源基因表达的经验使其在大多数科研应用中成为高效表达异源蛋白最常用的原核表达系统。尽管大肠杆菌有众多的优点，但并非每一种基因都能在其中有效表达。这归因于每种基因都有其独特的结构、mRNA的稳定性和翻译效率、蛋白质折叠的难易程度、宿主细胞蛋白酶对蛋白质的降解、外源基因和E.coli在密码子利用上的主要差别以及蛋白质对宿主的潜在毒性等等。但知识的大量积累还是有助于为表达方面某些特定的困难提供一般的解决方法。大肠杆菌作为表达系统的主要障碍包括：不能象真核蛋白那样进行翻译后修饰、缺乏将蛋白质有效释放到培养基中的分泌机制和充分形成二硫键的能力。另一方面，许多真核蛋白在非糖基化的形式下能保留其生物学活性，因而也就可以用大肠杆菌来表达。如何实现外源基因在原核细胞中的有效表达，自60年代以来，对影响外源基因在其表达体系中表达效率的各个因素作了大量实验研究，并有多篇归纳性综述发表[1，2，3]。国内针对外源基因在原核细胞中高效表达的关键因素，构建了高效表达载体

Cloning & Expression

Genotypes of Selected E. coli Strains

Genotypes of Selected E. coli Strains

BL21 E. coli B F– ompT gal [E. coli B is naturally dcm and lon] hsdSB

BL21(DE3) E. coli B F– ompT gal [E. coli B is naturally dcm and lon] hsdSB with DE3, a λ prophage carrying the T7 RNA polymerase gene and lacIQ

C600 F– [e14– (McrF–) or e14+ (McrF+)] thr-1 leuB6 thi-1 lacY1 glnV44 rfbD1 fhuA21

CJ236 F Δ(HindIII)::cat (Tra+ Pil+ CamR )/ ung-1 relA1 dut-1 thi-1 spoT1 mcrA

GC5 F′ endA1 hsdR17 (rK–mK+) glnV44 thi-1 recA1 gyr

大肠杆菌及其检验

大肠杆菌的生物学特性

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简介：

大肠埃希氏菌习惯称为大肠杆菌，分类于肠杆菌科，归属于埃希氏菌属，并且大肠杆菌株ATCC 11775是该属的模式菌种。 附：肠杆菌科各属

大肠杆菌的不同菌株间DNA相关性为80%，而与同科的志贺氏菌属（除鲍氏志贺氏菌外）的DNA相关性可达80-87%。

大肠杆菌为人和动物肠道中的常居菌，一般多不致病，在一定条件下可引起肠道外感染。

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形态与染色

大小0.4～0.7×1～3um,无芽胞,大多数菌株有动力。

有普通菌毛与性菌毛，有些菌株有多糖类包膜，革兰氏阴性杆菌。 附：有动力是什么意思？请看动力试验。

革兰氏阴性杆菌是什么意思？请看革兰氏染色介绍。 大肠杆菌扫描电镜照片 大肠杆菌透射电镜照片 大肠杆菌分裂照片

最新： 大肠杆菌革兰氏染色照片

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培养特性

由于此菌合成代谢能力强，在含无机盐、胺盐、葡萄糖的普通培养基上生长良好。

最适生长温度为37℃，在42-44℃条件下仍能生长，生长温度范围为15-46℃。

在普通营养琼脂上生长表现3种菌落形态：

1

（1）光滑型： 菌落边缘整齐，表面有光泽、湿润、光滑、呈

大肠菌群测定的操作细则

大肠菌群系指一群能发酵乳糖、产酸产气、需氧和兼性厌氧的革兰氏阴性无芽胞杆菌。该菌主要来于人畜粪便,故以此作为粪便污染指标来评价食品的卫生质量,推断食品中有否污染肠道致病菌的可能。 食品中大肠菌群数系以100mL(g)检样内大肠菌群最可能数(MPN)表示。 1 设备和材料 1.1 温箱：36±1℃。 1.2 冰箱:0～4℃。

1.3 恒温水浴 :44.5±0.5℃。 1.4 天平。 1.5 显微镜。 1.6 均质器或乳钵。 1.7 平皿:直径为90mm。 1.8 试管。 1.9 吸管。

1.10 广口瓶或三角烧瓶:容量为500mL。 1.11 玻璃珠:直径约5mm。 1.12 载玻片。 1.13 酒精灯。 1.14 试管架。 2 培养基和试剂

2.1 乳糖胆盐发酵管:按GB 4789.28中4.9规定。 2.2 伊红美蓝琼脂平板:按GB 4789.28中4.25规定。

2.3 乳糖发酵管:按GB 4789.28中4.10规定。 2.4 EC 肉汤:按GB 4789.28中4.11规定。

2.5 磷酸盐缓冲稀释液:按GB 4789.28中3.22规定。 2.6 生理盐水。

生物工程

如何构建一个大肠杆菌高校表达的分子克

隆

摘要：基因克隆是把一个外源基因导入生物细胞，并使它得到扩增。但是外源基因DNA片段一般不带有复制子系统及在新的受体细胞中进行功能表达的调控系统。如果要分子克隆在大肠杆菌中高效表达，则需要特殊的载体将克隆基因转入受体细胞，然后运用载体上的复制子和调控系统，进而实现分子克隆的高效表达。

关键词：强启动子，弱启动子，诱导，阻遏

基因克隆的重要环节，就是把一个外源基因导入生物细胞，并使它得到扩增。然而一个外源DNA片段是很难进入受体细胞的，即使进入细胞，一般也不能进行复制和功能的表达。这是因为，所得到的外源DNA一般不带有复制子系统及在新的受体细胞中进行功能表达的调控系统。这样，进行基因克隆是很困难的。在基因工程中，通常是把外源DNA片段利用运载工具送入生物细胞。

载体的本质是DNA。经过人工构建的载体，不但能与外源基因相连，导入受体细胞，还能利用本身的调控系统，使外源基因在新细胞中复制以及功能表达。 克隆基因的表达通常有三个必须条件：（1）基因的密码区不能被插入序列中断；（2）基因必须在启动子的控制之下，而启动子必须能被宿主细胞的RNA多聚酶有效地识别；（3）mRNA必须相当稳定，并且有效地被转译，产生的外源

大肠杆菌基因型和参考文献

Cloning & Expression

Genotypes of Selected E. coli Strains

Genotypes of Selected E. coli Strains

BL21 E. coli B F– ompT gal [E. coli B is naturally dcm and lon] hsdSB

BL21(DE3) E. coli B F– ompT gal [E. coli B is naturally dcm and lon] hsdSB with DE3, a λ prophage carrying the T7 RNA polymerase gene and lacIQ

C600 F– [e14– (McrF–) or e14+ (McrF+)] thr-1 leuB6 thi-1 lacY1 glnV44 rfbD1 fhuA21

CJ236 F Δ(HindIII)::cat (Tra+ Pil+ CamR )/ ung-1 relA1 dut-1 thi-1 spoT1 mcrA

GC5 F´ endA1 hsdR17 (rK–mK+) glnV44 thi-1 r

实验报告

题目:单元三:重组DNA在大肠杆菌中的诱导表达

指导老师:邓庆丽

日期:2013/10/31-201311/1

一．实验目的：

(1)了解和掌握IPTG诱导表达的原理和操作方法。 (2)了解降解物阻遏的现象及其机理。 二．实验原理：

本实验使用的是载体是已重组好的 pGFPuv ，宿主细胞为大肠杆菌，目的基因的产物为融合蛋白，目的蛋白为绿色荧光蛋白GFP，非目的蛋白即融合部分为标签6×His，用于单元

四的亲和层析分析。

本实验采用的启动子为可调控的强启动子乳糖操纵子lac。 操纵子是原核基因表达的协调单位。通常由2个以上功能相关的结构基因以及一些调节序列（如启动子序列、操纵序列等）组成。乳糖操纵子由三个结构基因Z、Y、A和操纵序列、启动子、CAP结合位点等调节序列组成，如下图1所示：

乳糖操纵子的调节包括诱导效应和降解物阻遏效应。 (1)诱导表达

当没有乳糖存在时，调节基因lacI表达，转录的mRNA翻译成阻遏蛋白。阻遏蛋白与操纵序列lacO结合，阻碍了结合在旁边启动子的RNA聚合酶向前移动，使目的基因（本实验中的绿色荧光蛋白基因GFP）不能转录，也就不能翻译出蛋白质。也就是说，当没有乳糖存在时，乳糖操纵子处

生物工程

如何构建一个大肠杆菌高校表达的分子克

隆

摘要：基因克隆是把一个外源基因导入生物细胞，并使它得到扩增。但是外源基因DNA片段一般不带有复制子系统及在新的受体细胞中进行功能表达的调控系统。如果要分子克隆在大肠杆菌中高效表达，则需要特殊的载体将克隆基因转入受体细胞，然后运用载体上的复制子和调控系统，进而实现分子克隆的高效表达。

关键词：强启动子，弱启动子，诱导，阻遏

基因克隆的重要环节，就是把一个外源基因导入生物细胞，并使它得到扩增。然而一个外源DNA片段是很难进入受体细胞的，即使进入细胞，一般也不能进行复制和功能的表达。这是因为，所得到的外源DNA一般不带有复制子系统及在新的受体细胞中进行功能表达的调控系统。这样，进行基因克隆是很困难的。在基因工程中，通常是把外源DNA片段利用运载工具送入生物细胞。

载体的本质是DNA。经过人工构建的载体，不但能与外源基因相连，导入受体细胞，还能利用本身的调控系统，使外源基因在新细胞中复制以及功能表达。 克隆基因的表达通常有三个必须条件：（1）基因的密码区不能被插入序列中断；（2）基因必须在启动子的控制之下，而启动子必须能被宿主细胞的RNA多聚酶有效地识别；（3）mRNA必须相当稳定，并且有效地被转译，产生的外源

大肠杆菌表达载体,载体介绍,载体图谱,载体应用,载体序列

pGro7

编号  

北京华越洋VECT-­‐340  

pGro7载体基本信息  载体名称:  质粒类型:  高拷贝/低拷贝:  启动子:  克隆方法:  载体大小:  

5'  测序引物及序列:  3'  测序引物及序列:  载体标签:  载体抗性

:  筛选标记:  备注:  稳定性:  质粒类型:  病毒/非病毒:    

pGro7  

Chaperone  Plasmid分子伴侣质粒  -­‐-­‐  -­‐-­‐  

多克隆位点，限制性内切酶  5.4kb  -­‐-­‐  -­‐-­‐  -­‐-­‐  

chloromycetin(氯霉素)  

大肠杆菌表达重组蛋白的超声破碎及纯化

一 可溶性蛋白的纯化

（一）菌体的破碎 1. 仪器与材料：-80℃冰箱；超声波细胞破碎仪；50mM PBS或50mM Tris-HCl pH 7.5；50ml 离心管；冷冻高速离心机

2. 方法

2.1反复冻融

2.1.1收集菌液500ml，等分10份，4000 r/min 4℃离心15min，弃上清。

2.1.2 菌体沉淀中加入相同菌液体积的50mM PBS 或50mM Tris-HCl（选择使蛋白稳定的缓冲液和pH）重悬洗涤一次。

2.1.3 然后按原菌液体积的1/4加入缓冲液重悬菌体，并加入蛋白酶抑制剂PMSF和EDTA(带His标签不加)，PMSF终浓度为100μg/ml, EDTA的终浓度为 。取20μl重悬菌液进行电泳，检测蛋白表达的情况（是否表达，是可溶性表达还是包涵体表达）。

2.1.4 将菌液（经检测有表达）在-80度冰冻，室温融解，反复几次（反复冻融三次），由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。

2.2 超声波处理 (对超声波及热敏感的蛋白慎用)

2.2.1 将反复冻融的菌液（必要时可加入1mg/ml 溶菌酶，缓冲液pH＞8.0，加入后需静置20m