pcr操作要点

【A型题】 在五个选项中选出一个最符合题意的答案（最佳答案）。 1．以下哪种物质在PCR反应中不需要（ ）

A．Taq DNA聚合酶 B．dNTPs C．Mg2+ D．RNA酶 E．合适pH缓冲液 2．以下哪种酶可耐高温（ ）

A．Taq DNA聚合酶 B．Hind Ⅲ C．T4连接酶 D．RNA酶 E．Klenow片段

3．PCR反应正确过程应为（ ）

A．退火→变性→延伸 B．变性→退火→延伸 C．退火→延伸→变性 D．变性→延伸→退火 E．延伸→变性→退火 4． PCR技术的本质是（ ）

A． 核酸杂交技术 B． 核酸重组技术

C． 核酸扩增技术 D． 核酸变性技术 E． 核酸连接技术

5．Taq DNA聚合酶酶促反应最适温度为（ ）

A．37℃ B．50℃～55℃ C．70℃～75℃ D．80℃～85℃ E．94℃～95℃

6．温度均一性较好的PCR仪为（ ）

A．水浴锅PCR基因扩增仪和压缩机PCR基因扩增仪 B．半导体PCR基因扩增仪和离心式空气加热PCR基因扩增仪 C．压缩机PCR基因扩增仪和半导体PCR基因扩增仪 D．压缩机PCR基因扩增仪和离心式空气加热PCR基因扩增仪 E．水浴锅PCR基因扩增仪和离心式空气加热

PCR引物设计要点

1. 书写规则

设计引物时，5’端引物与目的序列正义链相同，而3’端引物则与目的序列正义链互补，书写时从引物的5’端至3’端（即5’端引物不变，3’端引物与目的序列互补并相反）； 2. 引物长度

一般引物长度为18~30碱基（不包括5’端添加的修饰），引物太长和太短都不好； 3. GC含量

一般引物序列中G+C含量一般为40%~60%，不要有聚嘧啶或聚嘌呤，尤其3’端不应超过3个连续的G或C。若是引物存在严重的GC倾向或AT倾向则可以在引物5’端加适量的A、T或G、C尾巴，上下游引物的GC含量不能相差太大； 4. 退火温度

可以用软件PrimePrimer来计算退火温度，在引物短于20bp时，可以用公式Tm=4(G+C)+2(A+T)-5估计Tm值(解链温度)，有效引物的Tm为55~65℃之间较好，如果待扩增基因的GC含量较高（超过50%），引物的退火温度可设计得高一点，例如接近65℃，因为提高退火温度可以降低非特异性扩增。一对引物的退火温度应尽量接近，相差范围应在5℃之内；

一般初次PCR使用的退火温度比计算出的解链温度低5℃，如果扩不出，可试着将退火温度降低5℃ 和升高5℃再试一下，但一般不要1℃ 1℃升，或1℃ 1℃

PCR 引物设计的原则和要点

PCR 引物设计的原则和要点

http://www.77cn.com.cn 2005-5-13 9:13:57 来源：生物中国人

引物设计有3 条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。引物设计应注意如下要点：

1 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。

2 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率增加[2]。 3 引物3’端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3 个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A[3][4]。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。5’端序列对PCR 影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物[2]。 4 引物序列的GC 含量一般为40-60

PCR 引物设计的原则和要点

PCR 引物设计的原则和要点

http://www.77cn.com.cn 2005-5-13 9:13:57 来源：生物中国人

引物设计有3 条基本原则：首先引物与模板的序列要紧密互补，其次引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构，再次引物不能在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。引物设计应注意如下要点：

1 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA 聚合酶进行反应。

2 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3 个以上的连续碱基，如GGG 或CCC，也会使错误引发机率增加[2]。 3 引物3’端的末位碱基对Taq 酶的DNA 合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A 的错配效率明显高于其他3 个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A[3][4]。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR 反应失败。5’端序列对PCR 影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物[2]。 4 引物序列的GC 含量一般为40-60

用于检测细胞基因转录水平的实时定量PCR的操作流程

（Real Time Quantitative PCR Protocol For Detection of Gene Expression）

第一部分 原理

real time PCR 是普通PCR的一项改进，使用了针对扩增DNA的荧光物质，使得DNA的数量与检测到的荧光强度成线性关系，大致得到DNA的扩增曲线（如，图一）。

图一：引自美国应用生物系统中国公司网站——实时荧光定量的定量方法。

名词解释：

PCR ——一种科学准确

Rn:一个反应管经n次热循环后，测得的荧光强度。 Rn+:反应管含有模板DNA。 Rn-:反应管含有模板DNA。

无模板对照：No template control，Rn-，理想情况下，是一条平线，只具有背景荧光数值。 Threshold: 荧光（Rn）超过本底时的临界数值。 Ct: threshold cycle，临界循环数，threshold 横线与扩增曲线相交，所得交点所对应的循环数。 基线：baseline, 是背景曲线的一段，范围——从反应开始不久荧光值开始变得稳定，直到所有反应管的荧光都将要，但是还未，超出背景。

仪器：热循环仪器（GeneAmp Thermal Cycl

一、实验名称：RT-PCR实验

二、实验目的：对提取的完整RNA进行体外转录，并应用PCR手段进行大量扩增，说明某种基因在体内的表达情况。

三、背景知识：RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。。RT-PCR用于对表达信息进行检测或定量。另外，这项技术还可以用来检测基因表达差异或不必构建cDNA文库克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术，更灵敏，更易于操作。

四、基本原理：RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA

一、实验名称：RT-PCR实验

二、实验目的：对提取的完整RNA进行体外转录，并应用PCR手段进行大量扩增，说明某种基因在体内的表达情况。

三、背景知识：RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。作为模板的RNA可以是总RNA、mRNA或体外转录的RNA产物。。RT-PCR用于对表达信息进行检测或定量。另外，这项技术还可以用来检测基因表达差异或不必构建cDNA文库克隆cDNA。RT-PCR比其他包括Northern印迹、RNase保护分析、原位杂交及S1核酸酶分析在内的RNA分析技术，更灵敏，更易于操作。

四、基本原理：RT-PCR是将RNA的反转录（RT）和cDNA的聚合酶链式扩增（PCR）相结合的技术。首先经反转录酶的作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏而且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA

RT-PCR实验步骤

一．实验器具：

1.移液枪：1ml、200μl、20μl、10μl、2.5μl 2.吸头：1ml、200μl、20μl 3.匀浆管：5ml

4.EP管：1.5ml、500μl、200μl

5.试剂瓶：棕色试剂瓶(广口，放75%乙醇) 6.量筒：100ml 7.容量瓶：1000ml

8.试管架：5ml、1.5ml、20μl 9.铝制饭盒：1-2个 10.大瓷缸：1个 11.锡泊纸：一卷 12.卷纸：2卷

13.三角烧瓶：带盖，稍大

二．实验器具处理

1.塑料制品：(包括枪头、EP管、匀浆管等)先将DEPC水从容量瓶中倒入瓷缸中，将塑料制品逐个浸泡其中(注意：小枪头要充分浸泡，必要时需要针筒打入DEPC水)，过夜后取出(注意：DEPC水很难自然晾干，所以建议先将刚取出的DEPC物品甩干，枪头装入枪头盒后甩干，EP管和匀浆管装入饭盒后甩干，然后在37度孵箱烘干)。高压后烤干备用。如果DEPC处理过的物品时间已超过一个星期，再次使用前应再次高压。

2.玻璃制品：泡酸过夜，冲洗干净，先泡1‰DEPC过夜，再蒙锡纸烤干备用。 3.匀浆器：(包括剪刀、镊子)先洗净后，超声消毒即可(不需要泡DE

CFX96实时荧光定量PCF仪操作流程及注意事项

开始运行仪器

打开电脑

打开定量PCR仪底座开关

启动CFX Manager软件

放置样品

将PCR反应体系加入到0.2ml低缘八联管，盖上管盖；或加入低缘96孔板，用光学级封膜封好。注意，必须带一次性塑料手套，不要让手指接触到反应管表面。将反应管按顺序放入仪器的加热孔中。

设置程序，运行实验

定量PCR软件操作基本步骤为：a.设置热循环程序文件(Protocol Tab ) b.设置反应板文件

(Plate Tab )。C.点击“ Start RUn "键，运行程序热循环程序文件( Protocol Tab )设置指南：点击Edit (编辑)或Create NeW (创建新程序)。

反应板设置文件(Plate Tab )设置指南：选择本次实验所要使用的荧光染料种类；单击样品类型；

如要某些反应孔第一荧光染料对应的样品类型为标准品( Standard )，点击“ DiIUtiOn SerieS "键可设置其标准品浓度及稀释倍数。

点击“ Start Run"键。单击OPen lid (打开热盖)或Close lid (关闭热盖)放置样品；单击Start Run,保存文件，开始运行程序。

结果分析

PCR反应结束后，软件会

会计实务操作要点 一、会计实务中文书写要求 (1)要用蓝黑墨水或碳素墨水书写，不得用铅笔、圆珠笔(用复写纸复写除外)。红 色墨水只在特殊情况下使用。填写支票必须使用碳素笔书写。 (2)文字书写一般要紧靠左竖线书写，文字与左竖线之间不得留有空白部分。 (3)文字不能顶格写，一般要占空格的 1／2 或 2／3。 (4)文字要清晰，要用正楷或行书书写。 二、会计实务中数字书写要求 (1)阿拉伯数字书写要求 ?字体应当一个一个的写，不得连笔写。每个字要紧靠凭证或账表行格底线书写， 字体约占行格高度的 1/3，如果行格较低的可占 l／2。 ?阿拉伯数字前应写明币种符号， 币种符号与阿拉伯数字金额之间不得留有空白。 凡阿拉伯数字前有币种符号的， 数字后边不再写单位。 以元为单位的阿拉伯数字， 除表不单价外—律写到角分，无角分的，角分位写“00”或符号“—”；有角无分的， 分位应写“0”，不得写符号“—”。 (2)阿拉伯数字标准写法 ?字体要各自成形，大小匀称，排列整齐。 ?有圆圈的数字如 6、8、9、0 等圆圈必须封口。 ?字体要自右上方斜向左下方书写，倾斜度为 45 度。 ?写 6 时比—般数字向右上方长出 1／4， 7、 时比一般数字下方(过行格底线