常用生物实验技术

一，蛋白质电泳相关试剂及缓冲液

（一）30％（W/V）丙烯酰胺溶液

﹡组分浓度 30％（W/V） Acrylamide ﹡配制量 100ml ﹡配制方法

1．称取下列试剂，置于250ml烧杯中。 Acrylamide 29g BIS 1g

2．向烧杯中加入约80ml的去离子水，充分搅拌溶解；最后定容至100ml，用0.45μm滤膜过滤除杂。 3．置于棕色瓶中4℃保存。

（注意：丙烯酰胺具有强烈的神经毒性，可通过皮肤吸收并具有累积性。配制时应戴手套操作）

（二）40％（W/V）丙烯酰胺溶液

﹡组分浓度 40％（W/V） Acrylamide ﹡配制量 100ml ﹡配制方法

1．称取下列试剂，置于200ml烧杯中 Acrylamide 38g BIS 2g

2．向烧杯中加入约80ml的去离子水，充分搅拌溶解；最后定容至100ml，用0.45μm滤膜过滤除杂。 3．置于棕色瓶中4℃保存。

（注意：丙烯酰胺具有强烈的神经毒性，可通过皮肤吸收并具有累积性。配制时应戴手套操作）

（三）10％（W/V）过硫酸铵

﹡组

一，蛋白质电泳相关试剂及缓冲液

（一）30％（W/V）丙烯酰胺溶液

﹡组分浓度 30％（W/V） Acrylamide ﹡配制量 100ml ﹡配制方法

1．称取下列试剂，置于250ml烧杯中。 Acrylamide 29g BIS 1g

2．向烧杯中加入约80ml的去离子水，充分搅拌溶解；最后定容至100ml，用0.45μm滤膜过滤除杂。 3．置于棕色瓶中4℃保存。

（注意：丙烯酰胺具有强烈的神经毒性，可通过皮肤吸收并具有累积性。配制时应戴手套操作）

（二）40％（W/V）丙烯酰胺溶液

﹡组分浓度 40％（W/V） Acrylamide ﹡配制量 100ml ﹡配制方法

1．称取下列试剂，置于200ml烧杯中 Acrylamide 38g BIS 2g

2．向烧杯中加入约80ml的去离子水，充分搅拌溶解；最后定容至100ml，用0.45μm滤膜过滤除杂。 3．置于棕色瓶中4℃保存。

（注意：丙烯酰胺具有强烈的神经毒性，可通过皮肤吸收并具有累积性。配制时应戴手套操作）

（三）10％（W/V）过硫酸铵

﹡组

微生物学实验微生物学教研室 刘金林

P3/P4实验室

传统微生物技术 免疫学技术 分子微生物技术 以人为本，安全至上！ 以人为本，安全至上！

微生物学实验的任务学习研究与应用微生物的主要方法与技术， 学习研究与应用微生物的主要方法与技术 ， 掌握适应于从事相关学科的基础理论研究与 实际生产应用的微生物学实验技能。 实际生产应用的微生物学实验技能。 微生物学实验技能 与微生物学基础理论课紧密结合， 与微生物学基础理论课紧密结合 ， 在实验中 更深地理解基础理论， 更深地理解基础理论 ， 提高学生的综合能力 与创新意识。 与创新意识。 提高学生分析问题和解决问题的能力。 提高学生分析问题和解决问题的能力。 分析问题和解决问题的能力

教学要求注重微生物学基础实验技能的掌握与提高 注重微生物学 基础实验技能的掌握与提高， 克服盲 基础实验技能 的掌握与提高， 目追求新颖而忽视基础的倾向； 目追求新颖而忽视基础的倾向； 实验课前要预习，明确每次实验的目的与基本步骤； 实验课前要预习，明确每次实验的目的与基本步骤； 预习 在实验中要有严谨的科学态度 ， 尊重事实与实验结 在实验中要有 严谨的科学态度 严谨 的科学态度， 要善于发现新现象； 果，要

生物实验常用溶液的配制

一、DNA电泳相关：

1、DNA电泳缓冲液：

（1）Tris-乙酸（TAE）缓冲液：TAE较为常用，且价格低，但其缓冲能力较弱。所以TAE电泳需要蠕动泵使两极贮液槽进行液体循环，而且TAE需要经常更新；且要加入EDTA，目的在于鳌合二价离子，抑制DNase，以保护DNA。

① TAE使用液：

1×：40mmol/L Tris-乙酸 1mmol/L EDTA ② TAE贮存液（每L）： 50×：242g Tris碱 57.1ml 冰乙酸

100ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0）

（2）Tris-硼酸（TBE）缓冲液：

① TBE使用液：

0.5×：0.045mol/L Tris-硼酸 1mmol/L EDTA ② TBE贮存液（每L）： 5×： 54g Tris碱 27.5ml 硼酸

20ml 0.5mol/L EDTA（pH8.0）

（3）Tris-磷酸（TPE）缓冲液：

① TPE使用液：

1×：90mmol/L Tris-磷酸 2mmol/L EDTA ② TPE贮

实验1 糖化酶固定化技术

1 实验目的

(1)熟悉酶的固定化技术和原理。 (2)掌握糖化酶的固定化操作。

2 实验原理

在一定pH条件下，带正电荷的明胶与海藻酸根阴离子形成聚合物，同时，海

藻酸钠与钙离子在一定条件下结合形成不溶于水的微球，从而使混合于其中的糖化酶通过包埋固定化。戊二醛含有两个醛基，可与蛋白质中的氨基、酚基、巯基发生反应，相互交联而使固定化酶硬化，由于带正电荷的明胶与海藻酸根阴离子形成聚合物已将绝大部分游离酶包埋起来，因此这种交联主要发生在明胶与戊二醛之间，使固定化酶的使用时间延长、机械强度增大、稳定性提高。

3 仪器和试剂

3.1 主要仪器

磁力搅拌器，pH计，水浴锅，500mL烧杯，50mL注射器，12号注射器针头，冰箱。 3.2 药品及配制

（1）所需药品：糖化酶，明胶，海藻酸钠，氯化钙，戊二醛，生理盐水。 （2）活力单位为70U/mL的糖化酶酶液100ml：用所给糖化酶配制。 （3）浓度为3%的明胶溶液150ml：称取明胶4.5g，放入装有150mL蒸馏水的烧杯中，静止10分钟，水浴加热使明胶溶解，注意水浴的温度不超过70℃。

（4）3%的海藻酸钠溶液150ml：称取海藻酸钠4.5g，放入装有

实验室常用技术资料

Lab. experiment technology

LQ

细胞冻存

1. 实验前准备：细胞室及工作台紫外线照射30min；吹打管、中枪头、中枪、培养液、PBS、胰酶、小牛血清、DMSO、；收集对数生长期细胞，在冻存前一天最好换液 2．用吸管吸出培养瓶中的细胞培养液，PBS清洗2遍吸出冲洗液，加入1.5ml胰蛋白酶消化。 3. 适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。吸管吸取培养液吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。 4. 用吸管将培养液加入冻存管中，离心1000r/min，8分钟。(可以留下一部分细胞悬液在培养瓶中继续培养) 5. 用中枪吸去上清液直至冻存管内剩余1ml培养液，加入110ulDMSO(二甲基亚枫)，用枪头轻轻吹打使细胞均匀。

6. 冷存管置于4℃30min----20℃30min----80℃16～18小时(或隔

夜)---液氮槽长期储存。(-20℃不可超过1h，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些)。

7．记录每一个冷冻管的位置以确保在以后应用时能够找到每一个冷冻管。

细胞复苏

冷冻细胞之活化原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤

实验室常用技术资料

Lab. experiment technology

LQ

细胞冻存

1. 实验前准备：细胞室及工作台紫外线照射30min；吹打管、中枪头、中枪、培养液、PBS、胰酶、小牛血清、DMSO、；收集对数生长期细胞，在冻存前一天最好换液 2．用吸管吸出培养瓶中的细胞培养液，PBS清洗2遍吸出冲洗液，加入1.5ml胰蛋白酶消化。 3. 适时去掉胰蛋白酶，加入少量新培养液。吸管吸取培养液吹打瓶壁上的细胞，使其成为均匀分散的细胞悬液。 4. 用吸管将培养液加入冻存管中，离心1000r/min，8分钟。(可以留下一部分细胞悬液在培养瓶中继续培养) 5. 用中枪吸去上清液直至冻存管内剩余1ml培养液，加入110ulDMSO(二甲基亚枫)，用枪头轻轻吹打使细胞均匀。

6. 冷存管置于4℃30min----20℃30min----80℃16～18小时(或隔

夜)---液氮槽长期储存。(-20℃不可超过1h，以防止胞内冰晶过大，造成细胞大量死亡，亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中，惟存活率稍微降低一些)。

7．记录每一个冷冻管的位置以确保在以后应用时能够找到每一个冷冻管。

细胞复苏

冷冻细胞之活化原则为快速解冻，以避免冰晶重新结晶而对细胞造成伤

1、组织培养中常见污染的种类和途径

凡混入培养环境中对细胞生长有害的成分或造成细胞不纯的异物 微生物：细菌、真菌、病毒、支原体； 细胞以及化学物；

途径：空气；操作过程；血清；组织本身；清洗消毒不彻底 2. 在DNA重组中常用的工具酶及如何在DNA重组中应用它们？

（1）限制性内切酶：识别特异序列，切割DNA

（2）DNA连接酶：催化DNA中相邻的5′磷酸基与3′羟基间形成磷酸二酯键，使DNA

切口封合，连接DNA片段

（3）DNA聚合酶Ⅰ：a.合成双链cDNA中第二条链；

b.缺口平移制做探针；

c.DNA序列分析； d.填补3′末端；

（4）Taq酶 催化PCR反应，聚合DNA。 （5）反转录酶 a.合成cDNA；

b.替代DNA聚合酶Ⅰ进行填补，标记或DNA序列分析；

（6）多聚核苷酸激酶 催化DNA 5′羟基末端磷酸化，或标记探针； （7）碱性磷酸酶 切除DNA5′末端磷酸基；

（8）末端转移酶 在3′羟基末端进行同系多聚核苷酸加尾； （9）DNA酶：切割DNA； （10）RNA酶：切割RNA； 3. 双向电泳的定义及基本步骤

双向电泳是等电聚焦电泳和SDS-PAGE的组合，即先进行水平方向的等电聚焦电

《 生物技术专业大实验 》课程

课程编号：0741524966

实 验 指 导 书

主撰人 韩军丽 王雪青 金玉莲 赵培 审核人 王素英

天津商业大学 生物技术与食品科学学院

二零零九 年 十一月

前 言

1． 实验总体目标 使学生掌握基因工程、分子生物学、细胞生物学及细胞工程实验技术，

提高学生实验动手能力、以及在实验中分析问题和解决问题的能力，为今后从事生物技术相关工作和研究打下坚实的基础。

⒉ 适用专业年级 生物技术专业第6学期

⒊ 先修课程 生物化学、微生物学、遗传学、细胞与分子生物学、基因工程、细胞工程 ⒋ 实验课时分配

实验项目 实验一 目的基因的PCR扩增 实验二 DNA片段的回收 实验三 DNA的连接 实验四 大肠杆菌感受态细胞的制备 实验五 重组DNA的转化 实验六 快速分离大肠杆菌中的重组质粒 实验七 重组质粒的酶切鉴定 实验八 外源基因诱导表达及蛋白质检测 实验九 细胞凝集反应 实验十 细胞膜的渗透性 实验十一 细胞工程基础实验技术 实验十二 无菌操作及愈伤组织诱导技术 实验十三 微藻规模化培养 实验实验每组实验 要求 类型 人数 学时 必做 综合 2 必做 综合 2 必做 综合 2 必做

实验一 纤维素酶在果汁制备中的应用

一、实验目的：了解影响果汁出汁率、固形物含量及澄清度的各因素；掌握果胶酶、纤维素酶在果汁生产中的应用。

二、实验原理：水果中含有纤维素、果胶等大分子物质，在榨汁时，这些物质会影响出汁率并使榨出的果汁浑浊，易出现沉淀。添加纤维素酶、果胶酶可以将果胶、纤维素分解成小分子的可溶性的物质，从而提高出汁率并使果汁饮料澄清。 三、实验器材

1．实验材料：新鲜桔子

2. 主要仪器：榨汁机、恒温水浴锅、分光光度计 3．实验药品：纤维素酶、5%柠檬酸、10%柠檬酸钠 四、实验内容 1.工艺流程

桔子→清洗→去皮→榨汁→过滤→酶处理→比较酶处理前后果汁澄清情况，并测透光率 2.方法步骤

（1）清洗、去皮和榨汁：每小组同学取桔子2-3个（重约200g），冲洗干净，去皮后用榨汁机榨汁。

（2）过滤：用滤布将果汁过滤到烧杯中，用5%柠檬酸或10%柠檬酸钠将果汁pH调到纤维素酶的最适pH值，一般为pH 3.0左右。

（3）酶处理：取由（2）所得果汁20ml，加入0.1%的纤维素酶，在所用纤维素酶的最适作用温度（看包装说明）下保持30min，中间注意不断搅拌或震荡。

（4）测透光率：取加酶处理后的果汁上清液，以