土壤酶活性测定方法盐酸缓冲液

土壤酶活性测定方法

土壤脲酶的测定方法（苯酚钠—次氯酸钠比色法）

一、原理

脲酶存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。它是一种酰胺酶作用是极为专

性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和二氧化碳、水。土壤脲酶活性与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。

土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。本方法以尿素为基质，根据酶促产物氨与苯酚-次氯酸钠作用生成蓝色的靛酚，来分析脲酶活性。 二、试剂 1）甲苯

2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100ml。

3）PH6.7柠檬酸盐缓冲液：184g柠檬酸和147.5g氢氧化钾（KOH）溶于蒸馏水。将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释定容至1000ml。 4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5g苯酚溶于少量乙醇，加2ml甲醇和18.5ml丙酮，用乙醇稀释至100ml（A液），存于冰箱中；27gNaOH溶于100ml水（B液）。将A、B溶液保存在冰箱中。使用前将A液、B液各20ml混合，用蒸馏水稀释至

土壤酸性磷酸酶活性的测定

1．试剂配制

(1)0.115M p-硝基苯磷酸钠溶液

取10.67g p-硝基苯磷酸二钠（6H2O,分子量为371.1），溶于pH4.5通用缓冲液中并稀释至250ml.4摄氏度冰箱保存。

(2)通用缓冲液（pH4.5）（缓冲液久置会有沉淀）

原液由以下成分组成:

三羟甲基氨基甲烷12.1g 顺丁烯二酸11.6g 柠檬酸14g 硼酸6.3g

溶于500ml 1N NaOH（40g定容1L）中，加蒸馏水至1L。取原液200 ml，再加入0.1N HCL或浓HCL来调pH为4.5。最后稀释至1L，即得。 (3)甲苯

(4)0.5 mol/L Cacl2.2H2O溶液：

36.75g Cacl2.2H2O定容500ml. (无水CaCl2: 11.1g定容200ml) (5)0.5 mol/L NaOH溶液：20g NaOH定容1L. 2．测定步骤

取1g土壤，置于50ml三角瓶中，加4ml通用缓冲液（pH4.5）、0.25ml甲苯和1ml 0.115M p-硝基苯磷酸钠溶液,摇匀后，置于37℃恒温箱中1h。

培养结束后，加入1ml 0.5 mol/L氯化钙溶液和4ml 0.5 mol/L NaOH溶液，通过

土壤酸性磷酸酶活性的测定

1．试剂配制

(1)0.115M p-硝基苯磷酸钠溶液

取10.67g p-硝基苯磷酸二钠（6H2O,分子量为371.1），溶于pH4.5通用缓冲液中并稀释至250ml.4摄氏度冰箱保存。

(2)通用缓冲液（pH4.5）（缓冲液久置会有沉淀）

原液由以下成分组成:

三羟甲基氨基甲烷12.1g 顺丁烯二酸11.6g 柠檬酸14g 硼酸6.3g

溶于500ml 1N NaOH（40g定容1L）中，加蒸馏水至1L。取原液200 ml，再加入0.1N HCL或浓HCL来调pH为4.5。最后稀释至1L，即得。 (3)甲苯

(4)0.5 mol/L Cacl2.2H2O溶液：

36.75g Cacl2.2H2O定容500ml. (无水CaCl2: 11.1g定容200ml) (5)0.5 mol/L NaOH溶液：20g NaOH定容1L. 2．测定步骤

取1g土壤，置于50ml三角瓶中，加4ml通用缓冲液（pH4.5）、0.25ml甲苯和1ml 0.115M p-硝基苯磷酸钠溶液,摇匀后，置于37℃恒温箱中1h。

培养结束后，加入1ml 0.5 mol/L氯化钙溶液和4ml 0.5 mol/L NaOH溶液，通过

土壤酶活性测定方法

土壤脲酶的测定方法（苯酚钠—次氯酸钠比色法）

一、原理

脲酶存在于大多数细菌、真菌和高等植物里。它是一种酰胺酶作用是极为专

性的，它仅能水解尿素，水解的最终产物是氨和二氧化碳、水。土壤脲酶活性与土壤的微生物数量、有机物质含量、全氮和速效磷含量呈正相关。根际土壤脲酶活性较高，中性土壤脲酶活性大于碱性土壤。人们常用土壤脲酶活性表征土壤的氮素状况。

土壤中脲酶活性的测定是以脲素为基质经酶促反应后测定生成的氨量，也可以通过测定未水解的尿素量来求得。本方法以尿素为基质，根据酶促产物氨与苯酚-次氯酸钠作用生成蓝色的靛酚，来分析脲酶活性。 二、试剂 1）甲苯

2）10%尿素：称取10g尿素，用水溶至100ml。

3）PH6.7柠檬酸盐缓冲液：184g柠檬酸和147.5g氢氧化钾（KOH）溶于蒸馏水。将两溶液合并，用1mol/LNaOH将PH调至6.7，用水稀释定容至1000ml。 4）苯酚钠溶液（1.35mol/L）：62.5g苯酚溶于少量乙醇，加2ml甲醇和18.5ml丙酮，用乙醇稀释至100ml（A液），存于冰箱中；27gNaOH溶于100ml水（B液）。将A、B溶液保存在冰箱中。使用前将A液、B液各20ml混合，用蒸馏水稀释至

一．常用缓冲溶液的配制方法 1．甘氨酸—盐酸缓冲液（0.05mol/L） x ml 0.2mol/L甘氨酸＋y ml 0.2mol/L HCl，再加水稀释至200ml pH x/ml y/ml pH x/ml y/ml 2.2 50 44.0 3.0 50 11.4 2.4 50 32.4 3.2 50 8.2 2.6 50 24.2 3.4 50 6.4 2.8 50 16.8 3.6 50 5.0 甘氨酸Mr = 75.07，0.2mol/L甘氨酸溶液含15.01g/L 2．甘氨酸—氢氧化钠缓冲液（0.05mol/L） x ml 0.2mol/L甘氨酸＋y ml 0.2mol/L NaOH，加水稀释至200ml pH x/ml y/ml pH x/ml y/ml 8.6 50 4.0 9.6 50 8.8 50 6.0 9.8 50 27.2 9.0 50 8.8 10.0 50 32.0 9.2 50 12.0 10.4 50 38.6 9.4 50 16.8 10.6 50 45.5 甘氨酸Mr = 75.07，0.2mol/L甘氨酸溶液为15.01g/L 3．邻苯二甲酸—盐酸缓冲液（0.05mol/L，20℃） x ml 0.2mo

标准缓冲液的配制及常用数据 2004.11

标准缓冲液的配制及常用数据

一、标准缓冲液pH值与温度对照表

温度 四草酸氢钾 邻苯二甲酸氢钾 混合磷酸盐 硼砂 ℃ 0.05M 0.05M 0.025M 0.01M 5 1.67 4.00 6.95 9.39 10 1.67 4.00 6.02 9.33 15 1.67 4.00 6.90 9.28 20 1.68 4.00 6.88 9.23 25 1.68 4.00 6.86 9.18 30 1.68 4.01 6.85 9.14 35 1.69 4.02 6.84 9.11

二、常用缓冲溶液的配制方法

1． 甘氨酸–盐酸缓冲液（0.05mol/L）

X毫升0.2 mol/L甘氨酸+Y毫升0.2 mol/L HCI，再加水稀释至200毫升 pH X Y pH X Y 2.0 50 44.0 3.0 50 11.4 2.4 50 32.4 3.2 50 8.2 2.6 50 24.2 3.4 50 6.4 2.8 50 16.8 3.6 50 5.0 甘氨酸分子量 = 75.07，0.2 mol/L甘氨酸溶液含15.01克/升。 2．邻苯二甲酸–盐酸缓冲液（0.05 mo

一、过氧化物酶（POD）活性的测定

POD测定参照李合生等（2003）的愈创木酚法方法进行测定，略加改动。 测定：称取样品0.5g，加入5mL 1／15mol／L PH=7.0的磷酸缓冲溶液，冰浴研磨成匀浆，4℃条件下12000r/min离心15min，上清液为粗酶液。然后在试管中加pH 7.0的磷酸缓冲液2 ml，愈创木酚（0.2%）0.5ml，浓度为0.15%的H2O2 0.5ml，取0.3ml的酶提取液加入到试管中，空白以缓冲液代替。在470nm下测定其吸光度，加入酶液时开始计时，每隔30s读数一次，连续记录5分钟。以每分钟每克鲜重增加0.1的酶量作为一个酶活性单位。

△470 ×VT

POD活性=

0.01×t×Vs×W

式中：△470----反应时间内吸光度值的变化；

VT ----提取酶液的总体积（ml） t----反应的时间（min）

Vs ----测定时取用酶液体积（ml） W----样品鲜重（g）

二、多酚氧化酶（PPO）活性的测定

多酚氧化酶活性测定参照朱广廉等(1990)的方法，略加改动。

酶液制备：称取样品0.5g，加入5mL 0.1mol／L PH=6.0的磷酸缓冲溶液

一、过氧化物酶（POD）活性的测定

POD测定参照李合生等（2003）的愈创木酚法方法进行测定，略加改动。 测定：称取样品0.5g，加入5mL 1／15mol／L PH=7.0的磷酸缓冲溶液，冰浴研磨成匀浆，4℃条件下12000r/min离心15min，上清液为粗酶液。然后在试管中加pH 7.0的磷酸缓冲液2 ml，愈创木酚（0.2%）0.5ml，浓度为0.15%的H2O2 0.5ml，取0.3ml的酶提取液加入到试管中，空白以缓冲液代替。在470nm下测定其吸光度，加入酶液时开始计时，每隔30s读数一次，连续记录5分钟。以每分钟每克鲜重增加0.1的酶量作为一个酶活性单位。

△470 ×VT

POD活性=

0.01×t×Vs×W

式中：△470----反应时间内吸光度值的变化；

VT ----提取酶液的总体积（ml） t----反应的时间（min）

Vs ----测定时取用酶液体积（ml） W----样品鲜重（g）

二、多酚氧化酶（PPO）活性的测定

多酚氧化酶活性测定参照朱广廉等(1990)的方法，略加改动。

酶液制备：称取样品0.5g，加入5mL 0.1mol／L PH=6.0的磷酸缓冲溶液

磷酸盐缓冲液配制方法 Company number：【0089WT-8898YT-W8CCB-BUUT-202108】

L磷酸盐缓冲液（～）

pH L NaH2PO4(ml) L Na2HPO4(ml)

磷酸盐缓冲液

取磷酸二氢钠38.0g，与磷酸氢二钠5.04g,加水使成1000ml,即得。

磷酸盐缓冲液

甲液:取磷酸，加水至1000ml，摇匀。乙液：取磷酸氢二钠71.63g，加水使溶解成1000ml。取上述甲液与乙液混合，摇匀，即得。

磷酸盐缓冲液

取磷酸二氢钾100g，加水800ml，用盐酸调节pH至,用水稀释至1000ml。

磷酸盐缓冲液

取L磷酸二氢钠溶液一定量,用氢氧化钠试液调节pH值至，即得。

磷酸盐缓冲液

取磷酸二氢钾8.34g与磷酸氢二钾0.87g,加水使溶解成1000ml，即得。

磷酸盐缓冲液

取磷酸二氢钾0.68g,加L氢氧化钠溶液，用水稀释至100ml，即得。

磷酸盐缓冲液

取磷酸二氢钠1.74g、磷酸氢二钠2.7g与氯化钠1.7g，加水使溶解成400ml，即得。

磷酸盐缓冲液(含胰酶)

取磷酸二氢钾6.8g,加水500ml使溶解,用L氢氧化钠溶液调节pH值至；另取胰酶10g，加水适量使溶解，

土壤酶测定方法

芳基酰胺酶 Arylamidase （EC 3.4.11.2）

试剂：

1、THAM缓冲液（0.1 M，pH 8.0）：2.44 g 三羟甲基氨基甲烷溶于50 mL水中，用0.05 M H2SO4滴定调节pH，加水稀释溶液至200 mL。

2、L-leucine β-naphthylamide solution L-亮氨酸β-萘胺（8.0 mM）(2 mM)：称取0.2342 g L-亮氨酸β-萘胺盐酸盐溶于水，定容至100 mL。 3、Ethanol 乙醇：（95%）

4、Acidified ethanol 酸化乙醇（0.26 M HCl）：4.32 mL浓HCl加入乙醇中，用乙醇定容至200 mL。

5、p-Dimethylaminocinnamaldehyde solution 对二甲氨基肉桂醛溶液 (0.6 mg/mL)：0.12 g 对二甲氨基肉桂醛溶于乙醇，用乙醇定容至200 mL。 6、标准液β-萘胺溶液（β-naphthylamine）（125 ug/mL）：称取12.5 mg β-萘胺，75 mL蒸馏水，5 mL乙醇，用蒸馏水定容至100 mL。

7、β-萘胺标准曲线：分别吸取1，2，3，4，5，6 mL标